蛋白质分子量、等电点与 280nm 消光系数在线计算
三个量，三套依据，都写清楚出处：
分子量：各氨基酸残基平均分子量之和，再加一分子水（18.015）。用的是 ExPASy 的平均质量表， 不是单同位素质量——质谱看到的单同位素峰会比这个值小一些。
理论等电点 pI：用 EMBOSS iep 的 pKa 取值，二分法解「净电荷 = 0」时的 pH。
pKa 取值为：N 端 8.6、C 端 3.6、Asp 3.9、Glu 4.1、Cys 8.5、His 6.5、Tyr 10.1、Lys 10.8、Arg 12.5
（出处：EMBOSS iep 文档）。
摩尔消光系数 ε₂₈₀，用 Pace 等 1995 年的经验公式：
ε₂₈₀ (M⁻¹cm⁻¹) = 5500 × nTrp + 1490 × nTyr + 125 × n二硫键
出处：Pace, Vajdos, Lee, Grimsley & Gray, Protein Science 4:2411–2423 (1995)， ProtParam 与 EMBOSS 用的都是这一套值。
必须知道的边界：
- 理论 pI 假设没有静电相互作用、没有翻译后修饰。实测 pI 常常和理论值差 0.5 以上， 磷酸化、糖基化会让实测值更低。用它筛等电聚焦条件可以，当作准确值不行。
- ε₂₈₀ 只算 Trp、Tyr 和二硫键。一条不含 Trp 也不含 Tyr 的蛋白，A280 测浓度是无效的， 这类蛋白请改用 BCA 或 Bradford。
- 「1 mg/mL 的 A280」= ε₂₈₀ / 分子量，用于把吸光度直接换算成 mg/mL。
常见问题
理论 pI 和实测差很多正常吗？
正常。理论 pI 假设无静电相互作用、无修饰。磷酸化、糖基化都会显著改变实测 pI。
为什么我的蛋白 A280 测不出来？
序列里没有 Trp 和 Tyr 时 ε₂₈₀ 接近 0，A280 无效。改用 BCA、Bradford 或直接看 A205。
二硫键数量填多少？
还原条件下填 0。氧化态按实际二硫键数填，每个贡献 125 M⁻¹cm⁻¹。
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