qPCR 扩增效率与 Pfaffl 相对定量在线计算（标准曲线斜率求 E）
一、标准曲线求扩增效率
二、Pfaffl 相对定量（用实测效率校正）
2^-ΔΔCt 里的那个 2，意思是每个循环产物翻一倍——假设扩增效率正好 100%。 真实引物很少正好 100%。目的基因和内参差得多的时候，倍数会系统性偏移， 而且偏多少取决于 ΔCt 的大小，不是一个可以事后校正的常数。
要知道差多少，得先把效率量出来。做法是把模板做系列稀释，每个稀释度测 Ct， 以 log10(起始量) 为横轴、Ct 为纵轴拟合直线：
Ct = slope × log10(起始量) + 截距
E = 10^(−1/slope)
效率(%) = (E − 1) × 100%
效率 100% 对应 E = 2，斜率 = −1/log10(2) = −3.3219。
判断标准（MIQE 指南）：效率落在 90–110%（斜率 −3.6 ~ −3.1），R² > 0.99。 超出这个范围的引物不该直接拿来做相对定量。
效率不达标时不要硬套 2^-ΔΔCt，改用 Pfaffl 法，用各自实测的 E 作底数：
(E_target)^[Ct(对照,目的) − Ct(样本,目的)]
比值 ratio = ────────────────────────────────────────────
(E_ref)^[Ct(对照,内参) − Ct(样本,内参)]
两个效率都恰好等于 2 时，这个式子会精确退化成 2^-ΔΔCt——它是后者的推广，不是另一套东西。
几个容易出错的地方：
- 稀释系列要覆盖你实际样本的 Ct 范围。只在高浓度端做标准曲线， 外推到低浓度样本是没有依据的。
- 效率算出来大于 110% 通常不是「效率超过 100%」，而是有抑制物、 引物二聚体或稀释操作误差。真实的扩增不可能一个循环翻不止一倍。
- 效率是引物对 + 反应体系的属性，换了 mix、换了仪器就要重测。
- 标准曲线的 R² 高只说明线性好，不说明效率对。两个指标要分开看。
常见问题
效率算出来 105%，需要担心吗？
不用。MIQE 建议的可接受范围是 90–110%，105% 在范围内。扩增效率超过 100% 在数学上不代表一个循环翻了不止一倍，而是标准曲线拟合的不确定度、稀释误差或轻微抑制造成的。真正要处理的是超出 90–110% 的情况。
目的基因和内参效率差多少算「差得多」？
没有一刀切的阈值，因为影响大小取决于 ΔCt。可以直接用上面的第二个计算器试：填入两个实测效率和你的 Ct，看 Pfaffl 比值和 2^-ΔΔCt 差多少。差异在你关心的效应量之内就可以接受。
标准曲线的起始量填什么单位？
ng、拷贝数、相对稀释倍数都行，只要同一列单位统一。斜率只取决于各点之间的比例关系，不取决于绝对单位——换单位只改变截距，不改变斜率和效率。
Pfaffl 法需要每次实验都做标准曲线吗？
效率是引物对加反应体系的属性，同一套体系测一次即可复用，不必每块板都做。但换 mix、换仪器、换退火温度之后要重测。原文的模型本身不需要每次跑校准曲线，这也是它相对于绝对定量的便利之处。
为什么效率要写成 E 而不是百分比？
E 是每循环的扩增倍数，直接进指数运算；百分比是 (E−1)×100。E = 2 即 100%，E = 1.9 即 90%。填表时注意别把 90 直接填进去。