硫酸铵盐析计算器：蛋白质分级沉淀的固体用量
盐析（salting-out）与硫酸铵分级沉淀
高浓度盐会争夺蛋白质表面的溶剂化水，使蛋白质溶解度下降并聚集沉淀。 不同蛋白质开始沉淀所需的盐浓度不同，利用这个差异做粗分离就是分级沉淀。 硫酸铵溶解度极高、便宜、基本不破坏活性，是首选试剂。
用量习惯用百分饱和度而不是 mol/L：温度确定时两者可以精确换算， 而且历史文献和教科书的表格都是按饱和度列的。
公式
每升溶液需加的固体克数 A = Gsat × (s₂ − s₁) ÷ (1 − P × s₂)
s₁、s₂ 是饱和度的**分数**（50% 写成 0.5）
Gsat = 1 升饱和溶液中含的硫酸铵克数
P = 比容 × Gsat ÷ 1000 （比容 = 1 g 固体占的体积，mL/g）
分母里的 (1 − P·s₂) 是对「加入固体本身占体积」的校正。省掉它会系统性低估：
目标 50% 时少算 13.6%，目标 80% 时少算 21.8%。
四个温度的常数（Wingfield 2001, Appendix 3F 的表 A.3F.1，原表 adapted from Dawson et al. 1986）：
| 温度 | Gsat (g/L 饱和液) | 比容 (mL/g) | P | 饱和摩尔浓度 |
|---|---|---|---|---|
| 0 °C | 515.35 | 0.5281 | 0.27216 | 3.90 M |
| 10 °C | 524.60 | 0.5357 | 0.28103 | 3.97 M |
| 20 °C | 536.49 | 0.5414 | 0.29046 | 4.06 M |
| 25 °C | 541.80 | 0.5435 | 0.29447 | 4.10 M |
P 不是另外查来的数，是由同一张表的比容和 Gsat 现算的—— 算出来的 0.27216 与 0.29447 正好是该文给的 0.2722 与 0.2945。
温度升高需要的盐更多，不是更少。 25 °C 的饱和溶液含盐比 0 °C 多 （541.80 对 515.35 g/L），所以达到同一个饱和度要称更多： 目标 30% 时多 5.9%，80% 时多 7.6%。在冷室配的方子直接搬到室温会偏低。
可以验算
该文的 Table A.3F.2 是 0 °C 下的实测表（把比容随浓度的变化也算进去了）。 挑几个正好落在表格列上的饱和度对照，公式作为闭式近似比表值高 0.1%–1.9%：
| 目标（0 °C 起点 0%） | 实测表 | 本工具 |
|---|---|---|
| 25.641%（1.00 M） | 140 g/L | 142.1 g/L（+1.5%） |
| 51.282%（2.00 M） | 302 g/L | 307.1 g/L（+1.7%） |
| 76.923%（3.00 M） | 495 g/L | 501.4 g/L（+1.3%） |
| 100%（3.90 M） | 707 g/L | 708.1 g/L（+0.1%） |
这个 1–2% 的差是方法差，不是算错：公式用定值比容，表格用的是随浓度变化的真实值。 需要更准就直接查表，公式的好处是任意起点终点都能算。
适用范围
- s₁ 取 0%–80%，s₂ 大于 s₁ 且不超过 100%。
- 温度按实际操作选。0 °C 那套覆盖冷室（0–4 °C）；没有恰好对应的档位时 选最近的，相邻两档之间的差约 2%。
- 起始缓冲液的本底盐浓度应可忽略（≤ 0.2 M），否则实际用量会偏。
- 不适用于加液体饱和溶液的情形，那是另一条公式（稀释效应不同）， 该文的 Table A.3F.3 专门给这种情况。
常见错误
- 搞反两步盐析的收弃方向。 典型流程是低饱和度离心后丢弃沉淀（杂蛋白）、 取上清，再升高饱和度收集沉淀（目标蛋白）。方向搞反，全部劳动归零。
- 一次倒入固体。 应持续搅拌下分批缓慢加入，到目标饱和度后再静置平衡 30 分钟才离心。快速倾倒会造成局部过饱和，引起非特异共沉淀。
- 省略分母的体积校正项。 简化成
Gsat × (s₂−s₁)时，目标 80% 处少算 21.8%， 称出来的量根本到不了目标饱和度。 - 把冷室的方子搬到室温。 温度高需要的盐更多（见上），方向容易记反。
常见问题
为什么用固体而不是饱和硫酸铵溶液？
加固体不稀释样品，这在样品本来就少、或后面还要上柱时很重要。加饱和溶液的好处是不会有未溶解的颗粒、局部过饱和的风险小，代价是体积被稀释（加到 50% 饱和度意味着体积翻倍）。两者的计算公式不同，本工具只算**加固体**的情形；加饱和溶液要用 Wingfield (2001) 的 Table A.3F.3。
分母里那一项是什么意思？
`(1 − P·s₂)` 是对**固体自身占体积**的校正。加进去的盐溶解后会撑大体积，而饱和度是相对于最终溶液定义的，所以要达到目标饱和度得比朴素算法多加。省掉这一项在目标 50% 时少算 13.6%，80% 时少算 21.8%——称出来的量根本到不了目标饱和度。P 本身是由比容和 Gsat 算的（比容 × Gsat ÷ 1000），算出来正好是该文给的 0.2722（0 °C）与 0.2945（25 °C）。
冷室 4 °C 用哪一档？
用 0 °C 那档。该文的表只给了 0 / 10 / 20 / 25 °C 四个温度，4 °C 离 0 °C 最近，而相邻两档之间的用量差约 2%，远小于盐析本身的批次波动，不必插值。**要注意的是方向**：温度越高需要的盐越多（25 °C 饱和液含盐 541.80 g/L，0 °C 只有 515.35），把冷室的方子直接搬到室温会偏低 6% 左右。
饱和度该怎么分级？
没有通用答案，要自己摸。常见做法是先做一次宽的梯度（比如 0–30%、30–50%、50–70%、70% 以上四段），各段的沉淀和上清都跑胶看目标蛋白在哪，再把切点收窄到 5%–10% 一档。两步盐析的方向容易记反：低饱和度那一步通常是**丢弃**沉淀、取上清，高饱和度那一步才是**收集**沉淀。
算出来的体积增量准吗？
那是固体溶解后自身占的体积，等于克数乘该温度的比容（0 °C 是 0.5281 mL/g，25 °C 是 0.5435）。它不包括盐溶解时的热效应或蛋白质沉淀后的体积变化，所以当估算用。真要精确知道终体积，该文给了专门的表（A.3F.4 / A.3F.5）。工具原来对所有温度都用 0.54 mL/g，那其实是 25 °C 的值。