比尔-朗伯定律计算器：吸光度、消光系数与浓度互算

核心公式

比尔-朗伯定律（Beer-Lambert Law）描述光穿过溶液时被吸收的程度：

A = ε × c × l

• A（Absorbance，吸光度）：量纲为一，分光光度计直接读出，也常写作 OD（Optical Density）。
• ε（Molar Extinction Coefficient，摩尔消光系数，又称摩尔吸光系数）：单位 M⁻¹cm⁻¹（= L·mol⁻¹·cm⁻¹），表示该物质在特定波长下对光的固有吸收能力，须查文献或手册，与样品浓度无关。
• c（concentration，摩尔浓度）：单位 mol/L（M）。
• l（path length，光程）：单位 cm，标准石英比色皿为 1 cm。

四个变量已知任意三个，即可求第四个：

求浓度：c = A / (ε × l)
求消光系数：ε = A / (c × l)
求吸光度：A = ε × c × l
求光程：l = A / (ε × c)

常用参考消光系数

NADH 在 340 nm 的 ε = 6 220 M⁻¹cm⁻¹ 是生化实验中被引用最广的消光系数，所有依赖 NAD⁺/NADH 辅因子的酶活测定（乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶等）均用此值换算，与 Avogadro 常数一样是可直接使用的已知量。

适用边界

1. 线性区间 A = 0.1–0.8：超过 1.0 时，杂散光与检测器非线性使读数偏低，浓度被系统性低估。若样品偏浓，稀释后重测，再乘稀释倍数复原。
2. 单色光：该定律假设入射光为单一波长。使用宽带滤光片时，高吸光度区会出现正的非线性误差。
3. 稀溶液：浓度过高（通常 > 10 mmol/L）时，溶质分子间相互作用改变电子环境，ε 不再是常数，定律失效。
4. 澄清均一溶液：悬浊液或含颗粒样品会因散射（Tyndall 效应）使吸光度虚高，此时测得的“浓度”无意义，须先离心澄清。

常见误用

• 忘记扣空白：测前须以纯缓冲液为参比清零；否则溶剂本身的吸收叠入读数，浓度偏高。
• 酶标仪默认光程 1 cm：96 孔板每孔生长面积 0.32 cm²（Gibco 的 Useful Numbers，站内 培养容器换算 用的是同一份），100 µL 的液层约 0.31 cm，按 1 cm 算会把浓度低估约 3.2 倍。实际光程还随孔型和弯月面变化，多数酶标仪能直接测光程并自动校正，能用就用测出来的值。
• 混用质量消光系数（L·g⁻¹·cm⁻¹）与摩尔消光系数：两者相差一个摩尔质量因子，量纲不同，混用结果会差一个数量级。

验算算例

情境：LDH 酶活测定，1 cm 比色皿，监测 340 nm 处 NADH 的吸光度随时间下降。

t = 0 s：A = 0.755
t = 60 s：A = 0.133
ΔA = 0.755 − 0.133 = 0.622
（两个测定点均落在线性区 0.1–0.8 内）

ε = 6 220 M⁻¹cm⁻¹，l = 1 cm

Δc = ΔA / (ε × l)
   = 0.622 / (6 220 × 1)
   = 1.000 × 10⁻⁴ mol/L
   = 100.0 µM

60 秒内消耗 NADH 恰好 100 µM，此结果可直接用于折算酶活力（µmol/min）再除以蛋白量得比活（µmol/min/mg）。