双荧光素酶报告基因归一化计算器（Firefly / Renilla 相对荧光素酶活性）

原理

双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporter assay）同时转入两个质粒：一个含目的调控元件（启动子、增强子、UTR 等）驱动的萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，FLuc），一个含组成型启动子（常用 CMV、TK、RSV）驱动的海肾荧光素酶（Renilla luciferase，RLuc）作为内参。由于两种酶底物不同（萤火虫素 vs 腔肠素），可在同一份裂解液中依次加底物检测，板读仪依次给出两路 RLU（Relative Light Units）读数。

「双」的核心价值是消除孔间转染效率差异。同一块板上各孔的转染效率可以相差 20–40%；若只看 Firefly 读数，这个技术差异会被误读为生物学效应。Renilla 由同一孔内的细胞产生，反映的是转染效率与裂解步骤的共同影响，而非实验处理。用 Firefly/Renilla 比值作为每孔的归一化活性，可以在同一块板内消除这类批次误差，使不同处理组之间的比较更加可靠。

核心公式

第一步：每孔归一化活性（dimensionless，无量纲）

Normalized = Firefly_RLU / Renilla_RLU

第二步：按实验组分组，计算均值和样本标准差（除以 n − 1）

Group mean = mean(Normalized_1, Normalized_2, …)
Group SD   = sample_std(Normalized_1, Normalized_2, …)

第三步：折叠诱导倍数（fold induction），以对照组均值为基准归一

Fold induction = Group mean / Control group mean

注意：Firefly 和 Renilla 的绝对 RLU 值不可直接比较（底物和检测波长均不同），归一化后的结果和折叠倍数均为无量纲数，不附单位。

适用边界

• Renilla 必须对实验处理不敏感。本公式的前提假设是 Renilla 只反映转染效率和裂解步骤，不随实验处理变化。已知可改变 CMV 启动子活性的处理（IFN-γ、HDAC 抑制剂、类固醇、多种病毒感染）会使归一化失效。建议在实验设计阶段验证内参读数不随处理变化，或改用对上述因素不敏感的 TK-Renilla / RSV-Renilla 载体。
• 两个信道均需高于检测背景。若 Firefly 或 Renilla 读数接近空白孔背景，微小波动就会被比值放大；通常要求两个信道的信噪比均 > 10:1。
• 适用于瞬时转染。稳定整合系统中内参与实验载体的拷贝比已固定，孔间归一化不再必要；此时若仍使用 Renilla 归一化，需另行评估其合理性。
• 样本量过小（n < 3）时标准差仅供参考，不建议据此进行显著性检验。

数据格式

在文本框里按「组名 → Tab → Firefly RLU → Tab → Renilla RLU」格式粘贴，每行一个孔，复孔占多行。可直接在 Excel 或 Google 表格中选中三列后 Ctrl+C，再粘贴到工具，制表符会自动识别。组名区分大小写，需与「对照组名称」输入框精确匹配。有表头行时工具会自动跳过（检测到首行含非数字内容）。

可以验算

手算核对： - 9240 / 4200 = 2.2000 ✓；27600 / 4600 = 6.0000 ✓；36300 / 5500 = 6.6000 ✓ - 对照组 mean = (2.0000 + 2.2000) / 2 = 2.1000 - 处理组 mean = (6.0000 + 6.6000) / 2 = 6.3000 - Fold induction = 6.3000 / 2.1000 = 3.0000

将上表数据（不含表头）粘贴到工具，对照组名称填「对照」，应得到与上述完全一致的结果。两组 Renilla CV 均约 12%，在可接受范围内（< 15%）。