FRET 效率与供受体间距在线计算器（荧光共振能量转移 Förster 公式）

荧光共振能量转移（FRET）三向换算：由距离和 Förster 半径算效率 E、由效率反推间距 R、或由供体荧光淬灭直接算效率，内置 Förster 公式，适用 2–14 nm 分子间距分析。

计算方向

Förster 半径 R₀（nm）

供受体间距 R（nm）

FRET 效率 E（%）

供体荧光强度 F_D（无受体样品）

供体荧光强度 F_DA（有受体样品）

什么是 FRET

荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence/Förster Resonance Energy Transfer）是激发态「供体」荧光团（donor）通过偶极-偶极耦合将激发能非辐射地传递给邻近「受体」荧光团（acceptor）的物理过程，不经过光子发射。耦合效率随间距的六次方衰减，因此 FRET 对 2–10 nm 范围内的距离变化极为敏感，被称为「分子尺」，广泛用于蛋白质构象变化、蛋白质相互作用、核酸结构及细胞信号转导的实时监测。

核心公式

FRET 效率 E（能量传给受体的比例，0 到 1 之间）与供受体发色团间距 R 的关系由 Förster 方程描述（Förster T, Ann. Phys. 1948;2:55-75；Stryer L, Annu. Rev. Biochem. 1978;47:819-846，PMID: 354506）：

E = 1 / (1 + (R / R₀)^6)

反算间距：

R = R₀ × ((1 - E) / E)^(1/6)

式中 R₀ 是 Förster 半径：其定义就是 E = 0.5（50%）时对应的间距，是每对供受体染料的固有参数。

第三种模式由供体荧光的淬灭程度直接测效率，无需 R₀：

E = 1 - F_DA / F_D

F_D 是无受体标记的同批次供体样品的荧光强度；F_DA 是供受体双标样品中供体通道的荧光强度。

Förster 半径 R₀

R₀ 由以下四个因素决定：

光谱重叠积分 J：供体发射谱与受体摩尔消光谱在波长上的重叠，重叠越大 R₀ 越大
供体量子产率 Φ_D：量子产率越高，R₀ 越大
取向因子 κ²：描述供受体跃迁偶极矩的相对取向；默认取 2/3，对应两个荧光团均可自由快速旋转的各向同性情形；荧光团被刚性固定时 κ² 可在 0 到 4 之间变化，会使 R₀ 偏移最多约 35%
折射率 n：水溶液通常取 1.33–1.40

本工具不计算 R₀，请从染料厂商手册或专项文献中查取自己实验中所用染料对的 R₀。常见参考范围：Cy3/Cy5 约 5.4 nm，ECFP/EYFP 约 4.9 nm，多数有机染料对在 3–8 nm 之间。同一染料对在不同溶剂、温度或蛋白质微环境下 R₀ 会有所偏移，文献值只能作为初步参考。

适用边界

灵敏区间为 0.5 R₀ 到 2 R₀（以 Cy3/Cy5 为例约 2.7–10.8 nm）：在此范围外，E 对 R 的变化近乎不敏感——R < 0.5 R₀ 时 E ≈ 1，R > 2 R₀ 时 E ≈ 0，由 E 反算 R 的误差会急剧放大，不适合定量分析
点偶极近似：Förster 方程将发色团视为点偶极子，当 R 小于约 1 nm（接近发色团自身尺寸）时理论不再适用
单对假设：公式针对一对供受体，不直接适用于每个供体对应多个受体、或存在多对 FRET 的情形
F_DA/F_D 方法的干扰：受体被直接激发产生的信号以及受体自发荧光均会污染供体通道的 F_DA 读数，需通过对照实验扣除；如有条件，FLIM 方法完全规避这一干扰

常见错误

用荧光强度法时供体浓度不匹配：若两个样品的供体浓度差 10%，算出的 E 就会有相应的绝对误差，在高效率（E > 80%）区尤为放大
在 R > 2 R₀ 的低效率区强行定量：E 非常小且仪器读数噪声与信号同量级，此时只能定性判断「有无 FRET」，无法可靠反推距离
把 R₀ 当作固定常数跨染料对使用：Cy3/Cy5 的 5.4 nm 对 Alexa 488/Alexa 647 无效；使用前必须查当前实验体系的 R₀

可以验算

下表中的数值由公式直接导出，不依赖任何外部测量，可手工或口算核对：

输入	计算步骤	预期结果
R₀ = 5.4 nm，R = 5.4 nm	(5.4/5.4)^6 = 1；E = 1/(1+1)	E = 50.00 %（R = R₀ 是 R₀ 的定义）
R₀ = 5.4 nm，R = 2.7 nm	(0.5)^6 = 0.015625；E = 1/1.015625	E = 98.46 %
R₀ = 5.4 nm，R = 10.8 nm	2^6 = 64；E = 1/65	E = 1.54 %
E = 50 %，R₀ = 5.4 nm（反算）	((1−0.5)/0.5)^(1/6) = 1；R = 5.4×1	R = 5.400 nm（与第一行互为逆算）
F_D = 1000，F_DA = 600	1 − 600/1000 = 0.4	E = 40.00 %

常见问题

R₀ 是什么，去哪里找这个值？

Förster 半径 R₀ 是 FRET 效率恰好为 50% 时的供受体间距，由染料对的供体量子产率、光谱重叠积分和取向因子 κ² 共同决定。每对染料的 R₀ 是固有参数，需从染料厂商手册或专项文献中查取，不同染料对之间不能通用；常见有机染料对约在 3–8 nm 之间，本工具不负责计算 R₀。

由距离算 E 与由荧光算 E 有何不同，该选哪种？

由荧光强度计算（E = 1 − F_DA/F_D）是实验直接测量，能反映真实系综效率，但要求两个样品中供体浓度严格相同，任何浓度偏差都会传播到效率误差中。由 R 和 R₀ 计算属于正向预测（已知结构估算信号），依赖 R₀ 的准确性。若需规避浓度问题，荧光寿命成像（FLIM，E = 1 − τ_DA/τ_D）是细胞内 FRET 测量的推荐方法，但需要时间分辨仪器。

算出的 R 等于两个蛋白质表面之间的距离吗？

不等于。R 是两个发色团偶极中心的直线距离。荧光团通过柔性连接臂附在蛋白上，因此 FRET 测得的 R 通常比蛋白表面-表面距离大 0.5–2 nm。此外，当分子存在多种构象时，从系综平均效率反算的 R 不等于各构象距离的均值（Jensen 不等式）；单分子 FRET 可以区分不同构象子集。