核酸杂交探针 Tm 与洗膜温度计算器（Northern / Southern Blot）
核心公式
本工具基于两套经验公式，均收录于 Sambrook & Russell《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》第三版（2001），原始推导来自 Anderson & Young（1985，载于 Hames & Higgins 编《Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach》）和 Casey & Davidson（1977，Biochemistry 16(9):1882）。
DNA:DNA 探针
Tm = 81.5 + 16.6 × log₁₀([Na⁺]) + 0.41 × (%GC) − 675/N
RNA:DNA 探针（探针链为 RNA 时）
Tm = 79.8 + 18.5 × log₁₀([Na⁺]) + 0.584 × (%GC) − 820/N
参数说明：[Na⁺] 单位为 mol/L（输入框填 mM，工具自动除以 1000）；%GC 填 0–100 整数；N 为探针长度（核苷酸数）。
校正项（在基础 Tm 之上叠加）
| 校正因素 | DNA:DNA | RNA:DNA |
|---|---|---|
| 甲酰胺（每 1% v/v） | −0.72 °C | −0.35 °C |
| 碱基错配（每 1%） | −1.0 °C | −1.0 °C（近似） |
如何使用计算结果
工具给出三个温度建议，均以校正后的 Tm_eff 为基准：
- 标准严格度杂交温度（Tm_eff − 25 °C）：适用于多数 Northern / Southern blot，在灵敏度与特异性间取平衡。
- 高严格度洗膜温度（Tm_eff − 10 °C）：用于减少非特异信号或区分高度相似的同源序列。
- 低严格度洗膜温度（Tm_eff − 30 °C）：用于跨物种杂交或检测远缘同源区域。
实际操作中，杂交与洗膜通常在同一或相近温度进行；具体温度可根据背景情况在建议值 ±5 °C 内调整。
适用范围
- 探针长度：≥ 100 nt；短于此范围请改用最近邻法（本站另有工具）。
- Na⁺：10–1000 mM（超出此范围经验公式偏差增大）。
- GC 含量：20–80%；极端 GC 组成的误差更大。
- 甲酰胺：0–80%（v/v），实际杂交常用 30–50%。
公式不涵盖：错配的具体位置（仅按比例计算）、非碱基骨架修饰（生物素、DIG 标记等）、甲酰胺以外的变性剂（尿素、DMSO）。
常见错误
- Na⁺ 浓度量级填错：5× SSC ≈ 825 mM，不是 5 mM。
- RNA 探针误用 DNA 公式：RNA:DNA 双链更稳定，Tm 偏高；用 DNA 公式会低估 Tm，洗膜温度设得过低，背景增高。
- 忽略甲酰胺降 Tm 的效果后再设定杂交温度：50% 甲酰胺使 DNA:DNA 的 Tm 约降低 36 °C。若直接按“裸 Tm − 25 °C”安排温度却同时加了 50% 甲酰胺，实际杂交温度相当于在 Tm − 61 °C 附近操作，特异性会大幅下降。
可以验算
算例：DNA:DNA 探针，N = 500 nt，GC = 50%，Na⁺ = 825 mM（5× SSC），甲酰胺 50%，无错配。
| 步骤 | 计算 | 结果 |
|---|---|---|
| GC 项 | 0.41 × 50 | +20.5 °C |
| 长度项 | 675 ÷ 500 | −1.4 °C |
| 基础 Tm | 81.5 − 1.4 + 20.5 − 1.4 | 99.2 °C |
| 甲酰胺校正 | 0.72 × 50 | −36.0 °C |
| Tm_eff | 99.2 − 36.0 | 63.2 °C |
| 标准杂交温度 | 63.2 − 25 | 38.2 °C |
| 高严格洗膜温度 | 63.2 − 10 | 53.2 °C |
将上述参数输入工具可复现这组数值。若改用 6× SSC（990 mM）且 GC = 55%，同样条件下杂交温度约为 42 °C，与经典 Northern blot 协议吻合。
常见问题
杂交温度和 Tm 有什么关系？
Tm 是探针与靶序列形成的双链在该缓冲液条件下有 50% 解链的温度。杂交实验通常在 Tm − 25 °C（标准严格度）进行，以兼顾灵敏度与特异性；高严格度对应 Tm − 10 °C，用于减少非特异信号；低严格度对应 Tm − 35 °C，用于检测同源但不完全互补的靶序列。
常用 SSC 如何换算成 Na⁺ mM？
1× SSC（150 mM NaCl + 15 mM 柠檬酸三钠）≈ 165 mM Na⁺。常用换算：2× SSC ≈ 330 mM，5× SSC ≈ 825 mM，6× SSC ≈ 990 mM，20× SSC ≈ 3300 mM。本工具直接在输入框填换算后的 mM 值。
为什么要加甲酰胺？
甲酰胺破坏碱基间氢键，使 DNA:DNA 双链每增加 1%（v/v）Tm 降低约 0.72 °C。加入 50% 甲酰胺可将杂交温度从 ≥95 °C 降至约 42 °C，避免高温导致膜上核酸降解，同时降低非特异性背景。
RNA 探针杂交时该选哪种模式？
当探针是体外转录合成的 RNA（如 DIG 或放射性标记的 RNA 探针），或靶序列是 mRNA（Northern blot）时，选 RNA:DNA 模式。RNA:DNA 双链本身比 DNA:DNA 稳定约 10–15 °C，且甲酰胺对其 Tm 的降低效果（每 1% 降 0.35 °C）比 DNA:DNA 少一倍，若误用 DNA 公式会低估 Tm、导致洗膜温度过低而背景升高。
公式对短探针（< 100 nt）准确吗？
这套经验公式基于 ≥ 100 nt 的长探针推导，不适用于短寡核苷酸（引物量级）。短探针应使用最近邻热力学方法（本站「最近邻法 Tm 计算器」）。探针越短，675/N（或 820/N）项占 Tm 的比重越大，偏差也越显著。