显微镜像素尺寸与 Nyquist 采样（放大倍率够不够，看的是像素不是倍数）

「我用的是 60× 油镜」——这句话说明不了图像有没有分辨率。

物镜能分开的两个点，如果落进同一个相机像素，那个分辨率就没进到图里。 决定成像细节的不是放大倍数，是一个可分辨距离被几个像素采到。

三步

样品面有效像素 = 相机像元尺寸 × binning ÷ (物镜倍率 × 中间倍率)
分辨率 d（Rayleigh）= 0.61 × λ ÷ NA
够不够 = d ÷ 有效像素，要 ≥ 2.3

注意有效像素的单位是「样品上的微米」，不是传感器上的微米—— 放大倍率的作用就是把样品放大到传感器上，所以它在分母。

为什么是 2.3，不是 2

经典的 Nyquist 判据说采样间隔要小于半个最小可分辨距离，也就是 2 倍。 那条结论成立的前提是结构正好沿着像素网格的横竖方向排列。 生物样品不会这么配合：沿对角线方向的结构，像素网格在那个方向的间距是 √2 倍， 所以要把系数提到 2.3（有的资料用 2.8）才能采到。

验算

拿一组公开参数对一遍：λ = 550 nm、NA = 1.25、100× 物镜、12 µm 像元。

d        = 0.61 × 550 ÷ 1.25 = 268.4 nm
有效像素 = 12 ÷ 100          = 0.12 µm = 120 nm

资料上写的正是「分辨率约 268 nm」「有效像素 120 nm」。 本工具用的就是这两条式子，你可以拿自己系统的参数核对。

顺带说一句这组参数的结论：268.4 ÷ 120 = 2.24，差一点点不到 2.3。 100× 配 12 µm 像元听上去很富裕，实际是卡在线上的。

最常见的那个搭配，其实也在线上

60× / NA 1.40 油镜配 6.5 µm 像元的 sCMOS，是眼下最普通的荧光成像配置：

d        = 0.61 × 520 ÷ 1.40 = 226.6 nm
有效像素 = 6.5 ÷ 60          = 108.3 nm
d ÷ 有效像素 = 2.09

满足经典的 2 倍，不满足对角线修正后的 2.3 倍。 加一个 1.5× 中间镜变成 90× 总倍率，有效像素降到 72.2 nm、比值到 3.14， 代价是视场缩小到原来的 2/3、每像素收到的光子少一半多。 这个取舍没有标准答案，但它应该是被算出来的，不是被默认的。

过采样也要花钱

比值远大于 2.3 并不是越大越好：视场变小、每像素光子变少、 同样信噪比要更长曝光或更强激发，而后者直接换成光漂白和光毒性。 所以这个工具两头都会提示。

两个判据的区别

Abbe 判据 d = λ / (2·NA) 给的是光学系统能传递的最小周期结构， Rayleigh 判据 d = 0.61 λ / NA 给的是两个点光源刚好能被分开的距离， 后者更大也更贴近「我能不能看出这是两个点」这个问题，所以采样判断惯常用它。 本工具两个都给出来，采样结论按 Rayleigh 算。

用的是发射波长

λ 要填发射波长，不是激发波长——成像的是发出来的光。 GFP 约 510 nm，mCherry 约 610 nm，DAPI 约 460 nm。 换个通道分辨率就变，同一台镜子在红通道下更容易欠采样。

边界

• 这套算法只管横向分辨率与采样。轴向（z）分辨率另有公式，通常差 2–3 倍。
• NA 不可能超过浸润介质的折射率（空气 1.0、水 1.33、油约 1.515）。
• 共聚焦的实际分辨率还取决于针孔大小，这里给的是物镜的衍射极限。
• 结构光、STED、单分子定位这类超分辨方法突破的正是这条极限，不适用本式。

相关工具

投稿图的像素与物理尺寸换算见 图像分辨率与 DPI； 显微镜下计数的浓度换算见 血球计数板计数。