NGS 文库摩尔浓度与等摩尔混库计算器（Qubit ng/µL 转 nM）

核心公式

文库摩尔浓度由 Qubit 质量浓度与平均片段长度共同决定：

c (nM) = c_mass (ng/µL) × 10^6 / (660 × L_bp)

• c_mass：Qubit 荧光定量（dsDNA HS 试剂盒）给出的质量浓度，单位 ng/µL
• L_bp：Bioanalyzer 或 TapeStation 给出的平均文库片段长度，单位 bp，含接头
• 660：dsDNA 每碱基对的平均分子量，单位 g/mol

推导过程：dsDNA 分子量 = 660 × L g/mol；ng/µL 换算为 g/L 须乘以 10⁻³；除以分子量得 mol/L，再乘以 10⁹ 换算到 nM，化简后即得上式。

可验证算例（Lib-A，5.20 ng/µL，385 bp）：5.20 × 10⁶ / (660 × 385) = 5,200,000 / 254,100 ≈ 20.5 nM。

为什么要同时知道质量浓度和片段长度？

摩尔浓度衡量的是分子个数，而不是质量。同样 5 ng/µL 的两个文库，片段 200 bp 的分子数约是片段 400 bp 的两倍。按质量等量混库，短片段文库会贡献出两倍的模板分子，最终的测序深度差一倍——这是混库均一性失败最常见的根源。

关于“平均片段长度”

必须用包含接头在内的完整文库长度，即 Bioanalyzer 电泳图的平均峰值，不是插入片段（insert size）。Illumina 标准 TruSeq 接头约给插入片段加 120 bp（Y 形接头两侧合计）：插入 250 bp 的文库，完整片段约 370 bp。直接填仪器报出的数字即可，不需要手动加减。

等摩尔混库方案

标准流程分两步：

1. 将所有文库稀释至相同工作浓度 W（通常 10 nM），稀释溶剂用 TE buffer 或 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)：

V_TE = V_stock × (c / W − 1)

2. 从每个稀释后的文库各取等体积混合，即得等摩尔文库池。

若某文库原液浓度已低于目标工作浓度，无法稀释，应将目标工作浓度调低至所有文库均能达到的水平。

Illumina 上样浓度参考

混库后需进一步稀释至上样浓度（碱变性成单链后）：

以各仪器配套的 Denature and Dilute Guide 为准，上表仅供参考。

常见错误

用 NanoDrop 代替 Qubit：NanoDrop 基于 A260 吸光度，无法区分目标 dsDNA 与游离核苷酸或 RNA 残留，通常高估 10–50%，导致实际上样浓度偏低、测序 cluster 密度不足。

填入插入片段长度而非文库长度：会系统性低估文库浓度（偏低约 30%），导致按摩尔比混库时短片段文库实际比例偏高。

适用边界

• 仅适用于 dsDNA 文库（Illumina TruSeq、TruSeq Nano、Nextera 等 dsDNA 建库产物）
• 660 g/mol/bp 是四碱基均值近似，对于 GC 偏倚极端的文库（< 30% 或 > 70% GC）误差约 1–2%，对混库决策影响可忽略
• 片段长度分布宽（如 ATAC-seq 出现多峰）时，用主峰众数而非算术平均值，结果更准
• 不适用于 ssDNA 文库（小 RNA 测序），也不适用于直接 RNA 定量