qPCR 2^-ΔΔCt 相对定量在线计算

2^-ΔΔCt 法（Livak 法）是 qPCR 相对定量最常用的算法，三步：

ΔCt   = Ct(目的基因) − Ct(内参基因)          同一个样本内
ΔΔCt  = ΔCt(处理组样本) − ΔCt(对照组均值)
倍数  = 2^(−ΔΔCt)

指数里的 2 表示每个循环产物翻一倍，也就是假设扩增效率恰好是 100%。

这个假设是 2^-ΔΔCt 法最大的软肋。 如果目的基因和内参的扩增效率相差较大， 结果会系统性偏移。规范做法是先做标准曲线，确认两对引物效率都在 90–110% 且彼此接近； 差得多就改用 Pfaffl 法，用各自的实际效率作底数。 效率和 Pfaffl 比值可以用扩增效率计算器直接算。

其他要点：

• 内参必须在你的处理条件下真的稳定。缺氧、增殖变化会让 GAPDH、ACTB 不再可靠， 最好先用 geNorm/NormFinder 之类的方法筛内参。
• 技术重复用来评估上样误差，生物学重复才能做统计检验。用技术重复算 p 值是无效的。
• 统计检验应该在 ΔCt 或 ΔΔCt 层面做（这是近似正态的量），而不是在 2^-ΔΔCt 之后， 因为指数变换会把分布拉偏。