数字PCR（ddPCR）绝对定量计算器：泊松公式与置信区间
数字 PCR（digital PCR，ddPCR / dPCR）将一管 PCR 反应分散到数万个纳升级微液滴中，每个液滴独立完成扩增，终点时读取荧光信号并作二元判断（阳性 / 阴性）。靶分子在液滴间随机分配，服从泊松分布（Poisson distribution），因此阳性液滴的比例可以转化为绝对拷贝数——无需标准曲线，不受扩增效率影响。
核心公式
设每个液滴平均含 λ 个靶分子拷贝。按泊松分布，一个液滴恰好含 0 个拷贝（呈阴性）的概率为
P(阴性) = e^(-λ)
用实测阴性液滴比例代入：
N_neg / N_total ≈ e^(-λ)
两边取自然对数得到拷贝数/液滴：
λ = -ln(N_neg / N_total) = -ln(1 - N_pos / N_total)
除以液滴体积（换算为 µL）即得反应液中的浓度：
C_reaction (copies/µL) = λ / V_droplet_µL
若上机前对原始样品做了 D 倍稀释，还原到原始样本：
C_original (copies/µL) = C_reaction × D
95% 置信区间
阳性液滴数 N_pos 服从二项分布。本工具对比例 p = N_pos / N_total 采用 Wilson score 区间（在低阳性率或少液滴时比正态近似更可靠）：
p 的 95% 下界 p_lo = (2·N_pos + z² - z·√(z² + 4·N_pos·(1 - p))) / (2·(N_total + z²))
p 的 95% 上界 p_hi = (2·N_pos + z² + z·√(z² + 4·N_pos·(1 - p))) / (2·(N_total + z²))
z = 1.96（95% 置信水平）
再变换到 λ：λ_lo = -ln(1 - p_lo)，λ_hi = -ln(1 - p_hi)。注意方向：p 越大 → λ 越大，因此 p_hi 对应 λ_hi，p_lo 对应 λ_lo。
适用边界
| 条件 | 说明 |
|---|---|
| N_total ≥ 10,000 | Bio-Rad QX200 每孔约 20,000 液滴，精度足够 |
| 阳性比例 0%–85% | 超过 85%（λ > 1.9）时多占位误差急剧增大，应稀释重测 |
| N_pos = 0 | λ 点估计为 0；工具给出 95% 上限（即“该浓度以下有 97.5% 把握”），不报点浓度 |
| N_pos = N_total | 无法计算（ln(0) 无定义），样品过浓，必须稀释 |
常见错误
- 忘记泊松修正：直接用「阳性液滴数 / 总液滴数 / 液滴体积」，10% 阳性率就会低估约 5%，高阳性率下误差更大。
- 忘乘稀释倍数：算出的是反应液中的浓度，原始样品浓度 = 反应液浓度 × 稀释倍数。稀释 10 倍就要乘以 10。
- 雨滴设门不当：雨滴归入阳性还是阴性由仪器软件设门决定，设门前导出的计数会让结果偏高或偏低。
- 液滴体积用错：不同平台体积不同，Bio-Rad QX200 约 0.85 nL，填成 0.59 nL（Stilla）会使结果偏高 44%。
可以验算
取 N_total = 20,000，N_pos = 2,000，液滴体积 0.85 nL，稀释倍数 10：
p = 2000 / 20000 = 0.10000
λ = -ln(1 - 0.10) = -ln(0.90) = 0.10536 拷贝/液滴
C_reaction = 0.10536 / 0.00085 = 123.95 copies/µL
C_original = 123.95 × 10 = 1239.5 copies/µL（约 1240 copies/µL）
Wilson 区间 → 泊松变换后，反应液 95% CI 为 (118.6, 129.5) copies/µL，原始样品为 (1186, 1295) copies/µL。算例阳性率为 10%，远低于 85% 上限，在适用范围内。
本工具公式依据：Hindson BJ et al., Anal Chem 2011, 83(22):8604–8610（PMID 22035192）；置信区间方法参见 Bhat S et al., Anal Bioanal Chem 2009, 394(2):457–467（PMID 19340424）。
常见问题
为什么不能直接把阳性比例除以液滴体积？
当阳性率超过约 5% 时，相当比例的液滴里会包含 2 个或更多拷贝（多占位，multi-occupancy）。把这类液滴当成「只含 1 个拷贝」会系统性低估浓度：10% 阳性率下低估约 5%，50% 阳性率下低估约 28%。泊松公式 -ln(阴性比例) 从阴性液滴出发，把多占位的概率都算进去了。
阳性液滴比例超过 85% 时结果还可靠吗？
不建议。比例超过 85%（λ > 1.9 拷贝/液滴）时，多占位误差和置信区间均急剧扩大。应将样品稀释 10–100 倍后重新上机检测。
「雨滴（rain）」应如何处理？
荧光强度介于阳性与阴性之间的雨滴须在仪器配套软件（如 Bio-Rad QuantaSoft）中完成阈值设门后，才能得到正确的 N_pos 和 N_total。本工具只接受设门后的最终计数，不做设门判定。
液滴体积从哪里查？
不同平台不同：Bio-Rad QX200 / QX One 约 0.85 nL，Stilla Crystal Digital PCR 约 0.59 nL。请查阅仪器手册或厂商技术文档；液滴体积填错会使结果整体偏高或偏低。