透析换液轮次计算器（脱盐 / 去咪唑 / 缓冲液置换）

按缓冲液与样品体积比算出透析所需轮次和各轮残余浓度，并直观量化多轮换液相比一次大体积透析究竟好多少。

起始浓度（mM，或任意相对单位）

目标残余浓度（同单位）

样品体积（mL）

每轮透析缓冲液体积（mL）

公式来源

透析是一个分批平衡过程。每次换入新鲜缓冲液后，目标小分子（咪唑、DTT、盐等）在透析膜（dialysis membrane）两侧自由扩散直到浓度相等。假设膜完全通透且换液后充分混匀，则一轮透析后样品侧浓度为：

C_1 = C_0 × V_sample / (V_sample + V_buffer)

直觉：样品里的小分子被“稀释”到了 V_sample + V_buffer 的总体积里，然后随换出的 V_buffer 带走了相应比例。

重复 n 轮后：

C_n = C_0 × [V_sample / (V_sample + V_buffer)]^n

反解轮数（向上取整，因为轮数必须是正整数）：

n = ceil( ln(C_0 / C_target) / ln(1 + V_buffer / V_sample) )

总缓冲液体积 = n × V_buffer（mL）。

最重要的结论：分轮远优于一次大体积

很多研究者直觉认为“缓冲液总量相同，一次换和分次换没区别”——这是错误的。用同样 1000 mL 缓冲液处理 5 mL 样品（起始 250 mM，目标 1 mM）：

策略	每轮体积	最终浓度
1 次 × 1000 mL	1000 mL	1.24 mM（未达目标！）
2 次 × 500 mL	500 mL	0.025 mM
4 次 × 250 mL	250 mL	3.7 × 10⁻⁵ mM

一次 1000 mL（200:1 比例）连 1 mM 目标都达不到；分两轮 500 mL 效果约为一次的 50 倍；分四轮 250 mL 约为一次的 3.4 万倍。缓冲液用量完全相同，仅仅是多换了几次。

实践建议：2–4 轮是性价比最高的区间。轮数超过 4 收益递减，且每次换液都有样品损失和外源污染的风险。

适用边界

适用： - 对透析膜完全通透的小分子（Mr 远低于膜截留分子量 MWCO，通常 < MWCO 的 1/10）：咪唑（131 Da）、EDTA（292 Da）、DTT（154 Da）、NaCl（58 Da）等均符合 - 透析时间足以达到扩散平衡：4°C 过夜（12–16 小时）或室温 2–4 小时通常足够 - 样品体积基本稳定（样品与缓冲液渗透压接近，不发生明显膨胀或浓缩）

不适用： - 超滤浓缩（Amicon Ultra、Vivaspin）：通过加压过膜减小体积，机制与透析不同，公式不适用 - 脱盐柱（PD-10 / G-25 / NAP-5）：排阻色谱（size exclusion）一步分离，脱盐效率更高但样品体积会增大 20–25%，本公式不适用 - 样品蛋白浓度极高（如 >100 mg/mL）时，样品侧渗透压可能远高于缓冲液，体积显著缩小，实际稀释效果比计算值稍好，但变化幅度难以预测 - 目标分子分子量接近 MWCO（如去除 > 10 kDa 的小蛋白标签时），透膜效率不可预测

常见错误

错误 1：用线性外推估算轮数。 认为“r = 100 一轮去掉 99%，再来一轮就到 99.99%”——每轮是乘法而不是加法；第二轮是在第一轮残余浓度的基础上再乘同一比例。

错误 2：只说缓冲液体积而不说样品体积。 “500 mL 缓冲液透析”在样品 5 mL（r = 100）和样品 50 mL（r = 10）时效果差一个数量级——比例才是决定因素。

错误 3：用一次大体积代替多轮。 上面的表格已经量化了两者的差距；如果缓冲液充裕，分两轮是几乎没有代价的提升。

常见问题

多轮换液为什么比一次大体积透析效果更好？

用等量缓冲液时，分成 n 轮每轮 V_total/n 的效果远优于一次 V_total。以 V_sample=5 mL、V_total=1000 mL 为例：一次 1000 mL 后残余 1.24 mM（连 1 mM 目标都达不到）；分两轮 500 mL 后残余 0.025 mM；分四轮 250 mL 后残余 3.7×10⁻⁵ mM。缓冲液用量完全相同，分轮效果最多好出约 3.4 万倍。

公式成立的前提是什么？

（1）透析膜对目标小分子完全通透（Mr 远低于 MWCO 的 1/10）；（2）每轮换液后两侧充分扩散达到平衡；（3）样品体积在透析过程中不因渗透压差而显著改变。若样品侧蛋白浓度极高，渗透压高于缓冲液侧，体积可能缩小，实际结果会比计算值稍好。

适合哪些场景，不适合哪些？

适合：Ni-NTA / Co²⁺ 纯化后去除咪唑；去除 β-ME / DTT；换 MS 兼容缓冲液（NH₄HCO₃）；降低盐浓度为离子交换层析做上样预处理。不适合：超滤浓缩（Amicon / Vivaspin，体积减小主导的过程）；脱盐柱（PD-10 / G-25，排阻色谱，不是平衡稀释）；目标分子分子量接近截留值（通透性无法保证）。

残余浓度为什么永远不能到零？

每轮都是在当前浓度基础上乘以同一个比例因子（指数衰减），数学上无穷轮才能到零。实验上通常要求 <0.1% 起始浓度或 <某绝对阈值，工具会直接告知几轮可以满足。