FRAP 荧光漂白恢复分析：动态分数与扩散系数在线计算

荧光漂白恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP）是活细胞成像中最常用的蛋白质动态表征手段。实验过程是：用高强度激光将感兴趣区域（ROI）内的荧光蛋白永久漂白，然后记录来自未漂白区域的荧光分子扩散进来的恢复过程。由恢复曲线可以提取两个参数：动态分数（Mobile fraction，Mf）和表观扩散系数（Apparent diffusion coefficient，D）。

动态分数

细胞内的荧光蛋白可分为两类：能在实验时间窗口内自由移动的（动态部分）和被稳定结合、基本不动的（不动部分）。设三个荧光强度值：漂白前 F_pre、漂白后即刻最低值 F_0、恢复平台期 F_∞，则：

M_f = (F_∞ − F_0) / (F_pre − F_0)

Immobile fraction = 1 − M_f

公式直觉：分母 F_pre − F_0 是「如果所有分子都能移动」时的最大可能恢复幅度；分子 F_∞ − F_0 是实际达到的恢复幅度；二者之比即可移动分子的比例。F_∞ 通常略低于 F_pre（因存在整体光漂白），公式已自动处理，无需手动校正。

适用边界：该公式不依赖任何扩散或结合模型，对二维或三维情形同样适用，是 FRAP 实验中最稳健的参数。实验时间须足够长以达到真正的平台（通常 >> 3 倍 t_1/2），否则 F_∞ 被低估，M_f 也随之低估。

表观扩散系数

若荧光恢复曲线可由单指数函数合理拟合：

F(t) = F_∞ × (1 − e^(−t/τ))

则半恢复时间 t_1/2 = τ × ln2，再结合漂白斑等效半径 w，由二维均匀扩散假设得到：

D_app = w² × ln2 / (4 × t_1/2)  ≈  0.173 × w² / t_1/2

单位：w 以 µm 代入，t_1/2 以秒代入，D 的单位为 µm²/s。

公式假设与误差：此公式假设漂白斑轮廓为均一圆盘（top-hat）且恢复为单指数。Soumpasis（1983，Biophys J）的精确模型（基于贝塞尔函数）给出的 D 值比此式高约 29%，差别来自修正因子 0.224 对 0.173。在扩散主导、无明显结合-解离的体系中两者均合理；若蛋白兼有自由扩散与染色质结合（如组蛋白），恢复曲线为多组分，单指数拟合的 t_1/2 不再直接对应扩散系数，此时应使用双组分模型。

常见错误

• 把 F_pre 当成 F_∞ 计算：当整体光漂白存在时，F_pre > F_∞，这样做会高估不动分数。
• 漂白不充分（F_0 远高于背景）：ROI 内残余荧光越多，对 M_f 的低估越严重；建议漂白后 F_0 低于 F_pre 的 20%。
• w 填入了物镜视野内的坐标半径而非漂白斑本身的测量半径：两者相差可达数倍，导致 D 的误差成平方级放大。

可以验算

算例 1：F_pre = 1000，F_0 = 200，F_∞ = 850

M_f = (850 − 200) / (1000 − 200) = 650 / 800 = 0.8125
Immobile fraction = 1 − 0.8125 = 0.1875（18.75%）

算例 2：w = 2 µm，t_1/2 = 5 s

D_app = 2² × ln2 / (4 × 5)
      = 4 × 0.6931 / 20
      = 2.7726 / 20
      ≈ 0.139 µm²/s

0.1–0.5 µm²/s 是核内转录因子的典型范围（Phair & Misteli, Nature 2000, PMID 10766243），此结果符合预期。