SEC 凝胶过滤分子量估算计算器（Kav 标准曲线拟合）

输入凝胶过滤标准蛋白的洗脱体积与已知分子量，算出各自 Kav、拟合半对数标准曲线并估算未知样品的原生分子量——蛋白纯化与聚集体分析的日常柱校准。

空体积 Vo（mL）

总液体体积 Vt（mL）

标准品（每行一个，格式：分子量kDa, 洗脱体积mL）

未知样品洗脱体积（每行一个，mL）

工作原理

凝胶过滤色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）按蛋白质在溶液中的流体力学半径进行分离，反映其天然状态下的真实大小——包括多聚体、结合配体的复合物。每种蛋白质在柱上的位置由分配系数 Kav 描述：

Kav = (Ve − Vo) / (Vt − Vo)

Ve：蛋白质洗脱峰顶体积（mL）
Vo：空体积，即蓝葡聚糖 2000 的洗脱体积（柱间隙体积）
Vt：总液体体积，即小分子完全渗透后的洗脱体积

Kav = 0 表示蛋白质与蓝葡聚糖一同洗脱，完全被排阻；Kav = 1 表示能自由渗入全部孔道。球形蛋白在有效分离范围内的 Kav 一般为 0.05–0.95。

对一组已知分子量的球形标准蛋白，以 log₁₀(MW) 对 Kav 作图，在线性分离范围内呈良好线性关系。对此直线做最小二乘拟合，再将未知样品 Kav 代入即得估算分子量：

log10(MW) = slope × Kav + intercept
MW_估算  = 10 ^ (slope × Kav_未知 + intercept)

适用边界

适用：球形（近球形）蛋白质，分子量落在所用柱型额定分离范围内（Superdex 75: 3–70 kDa；Superdex 200: 10–600 kDa），至少 3 个标准品覆盖目标 MW 上下范围，未知样品 Kav 落在标准品之间（插值，不外推）。

不适用：

纤维状或高度非球形蛋白（胶原、肌球蛋白、双链 DNA）：流体力学半径远大于同质量球形蛋白，分子量被严重高估。
高度糖基化蛋白：糖链增大 Stokes 半径，高估幅度可达 10–40%。
变性条件下的 SEC（6 mol/L 盐酸胍等）：按展开链计算，须使用专门的变性链标准品，与本工具的标准曲线不兼容。

常见错误

用几何柱体积代替 Vt。 柱床几何体积（π r² × 床高）既不等于 Vo 也不等于 Vt，不可用于计算。Vt 必须由实测小分子洗脱体积确定，通常约为几何体积的 65–75%。

在标准曲线范围外外推。 未知样品 Kav 落在最小或最大标准品之外时，估算误差会快速增大；本工具会对此发出警告，请在扩展标准品范围后再使用估算值。

误用 SDS-PAGE marker 作为 SEC 标准品。 SDS-PAGE 标准品在 SDS 变性条件下使用，对天然 SEC 无任何参考意义，必须使用球形天然蛋白。

可以验算

以下算例采用典型 Superdex 200 10/300 GL 柱参数（Vo = 8.0 mL，Vt = 22.0 mL），标准品来自 Cytiva 凝胶过滤校准试剂盒：

标准品	MW (kDa)	Ve (mL)	Kav
铁蛋白	440	10.2	(10.2 − 8.0) / 14.0 = 0.157
醛缩酶	158	13.0	(13.0 − 8.0) / 14.0 = 0.357
卵清蛋白	43	16.5	(16.5 − 8.0) / 14.0 = 0.607
RNase A	13.7	19.0	(19.0 − 8.0) / 14.0 = 0.786

对这 4 个点做最小二乘回归，得 slope ≈ −2.39，intercept ≈ 3.04，R² ≈ 0.997。

对未知样品（Ve = 14.5 mL）：
Kav = (14.5 − 8.0) / 14.0 = 0.464（落在醛缩酶 0.357 与卵清蛋白 0.607 之间，属插值）
log₁₀(MW) = 3.04 − 2.39 × 0.464 = 1.93
MW ≈ 10^1.93 ≈ 85 kDa

常见问题

如何测定空体积 Vo？

通常用蓝葡聚糖 2000（Blue Dextran 2000）溶液过柱，在 620 nm 处追踪洗脱峰顶体积。该试剂分子量约 2000 kDa，远大于任何目标蛋白，被完全排阻在凝胶颗粒外，其洗脱体积即代表柱间隙体积（外水体积）。

如何测定总液体体积 Vt？

用可完全渗入凝胶孔道的小分子标记，常用乙酰丙酮（265 nm）、重铬酸钾（350 nm）或 NaCl（电导检测）。Vt 通常为几何柱体积（π r² h）的 65–75%，不能直接用几何体积代替——两者并不相等。

SEC 给出的分子量和 SDS-PAGE 为何不同？

SEC 测量流体力学半径（Stokes 半径），反映蛋白质溶液中的原生状态；SDS-PAGE 在变性条件下按多肽链线性质量分离。多亚基复合物在 SEC 按天然分子量洗脱，SDS-PAGE 只看到单亚基条带——两者的差异本身就是结构信息，而不是哪一个「错了」。

Kav 超出 0–1 范围怎么办？

Kav < 0 说明蛋白质洗脱体积小于 Vo，多见于聚集体或 Vo 测量偏大；Kav > 1 通常意味着 Vt 设置有误或柱效下降。两种情况均超出该柱的线性分离范围，分子量估算不可信，需先排查实验或仪器问题。

需要几个标准品？用哪些蛋白？

至少 3 个，建议 4–5 个，且 MW 范围覆盖目标蛋白上下各约 2–5 倍。常用 GE Healthcare / Cytiva 凝胶过滤校准试剂盒（铁蛋白 440 kDa、醛缩酶 158 kDa、卵清蛋白 43 kDa、RNase A 13.7 kDa 等球形天然蛋白）。SDS-PAGE 分子量标准在变性条件下使用，不适用于 SEC 校准。