DNA 连接反应计算器（载体与插入片段用量 / Ligation）
为什么要换算摩尔比？
T4 DNA 连接酶（T4 DNA Ligase）催化相邻 DNA 末端形成磷酸二酯键，识别的是 末端数量（即摩尔数），而非质量。因此连接实验的投料需要将质量（ng）换算为摩尔数（fmol），再按照合适的 insert : vector 摩尔比配料。直接按质量比混合会导致小片段严重过量或大片段严重不足，降低克隆效率。
核心公式
双链 DNA 每碱基对的平均分子量经验常数为 660 Da/bp（四种 dNMP 平均约 330 Da/nt，双链 × 2）。据此，任意片段的摩尔数为：
n (fmol) = mass(ng) × 10⁶ / (size(bp) × 660)
给定载体质量，按目标摩尔比 r（insert : vector）推导出所需插入片段质量：
insert 质量(ng) = 载体质量(ng) × insert 长度(bp) × r / 载体长度(bp)
此公式与 NEB、Addgene 官方计算器所用公式一致。
推荐摩尔比
| 末端类型 | 推荐 insert : vector 摩尔比 |
|---|---|
| 黏性末端（sticky end，4-bp 突出） | 3 : 1 — 5 : 1 |
| 平末端（blunt end） | 5 : 1 — 10 : 1 |
| TA 克隆（TA cloning） | 3 : 1 — 10 : 1 |
平末端连接效率远低于黏性末端，通常需要更高摩尔比、更长反应时间（16 °C 过夜）或在反应体系中添加 PEG 4000。
适用边界
- 公式仅适用于线性双链 DNA，不适用于单链 DNA、RNA 或环状质粒。
- 载体大小应填线性化后的大小（即限制酶酶切打开环状质粒后的长度），不是质粒原始总长。
- 本工具适用于经典 T4 连接酶反应体系；不适用于 Gibson Assembly（Gibson 组装）、Golden Gate 或 LR/BP 重组等无缝克隆方法，它们有各自的投料规则。
- 典型反应体系：10 µL 总体积，1 µL 10× T4 连接酶缓冲液，16 °C 孵育 1–16 h，或 25 °C 快速连接 5–15 min（速连体系）。
- 本计算给出理论投料量，实际克隆效率还受末端修复质量、载体去磷酸化程度（CIP/SAP 处理会降低连接效率，此时需适当提高 insert 摩尔比）、DNA 纯度及感受态细胞效率等因素影响。
验证断言（可手算核对）
- 载体 50 ng、3000 bp；insert 800 bp；摩尔比 3 → insert = 40.00 ng
- 载体 fmol = 50 × 10⁶ / (3000 × 660) ≈ 25.25 fmol；insert fmol ≈ 75.76 fmol
- 载体 100 ng、5000 bp；insert 500 bp；摩尔比 5 → insert = 50.00 ng
常见错误
- 载体大小填错：酶切质粒后载体大小 = 质粒总长 − 被替换的旧片段长度，不是质粒原始大小。
- 摩尔比方向填反：本工具填写的是 insert 相对于 vector 的倍数，填 3 代表 insert : vector = 3 : 1。
- 单位混用：直接填 ng 和 bp，不要换算为 µg 或 kb 后再填入。
- 忽视体积限制：10 µL 体系中，DNA 总体积通常不超过 7 µL，其余留给连接酶和缓冲液；DNA 太稀时需要先浓缩。
常见问题
载体是 5000 bp 质粒，酶切后去掉了 200 bp 的旧 insert，现在插入新 insert，载体大小该填多少？
填线性化骨架大小：5000 − 200 = 4800 bp。插入片段大小填你新 PCR 扩增的 insert 长度（不含引物添加的酶切位点碱基通常只有几个 bp，影响可忽略不计）。
载体经过 CIP（碱性磷酸酶）去磷酸化处理，需要提高 insert 摩尔比吗？
是的。CIP 处理后载体末端缺少 5′ 磷酸基，无法自身环化（防止空载体背景），但连接效率也会降低。建议将 insert : vector 摩尔比提高到 5 : 1 — 10 : 1，并延长连接时间至 16 °C 过夜。
Gibson Assembly 可以用这个工具计算吗？
不适用。Gibson Assembly 依赖外切酶暴露 15–30 bp 同源臂，其推荐摩尔比和最优 DNA 用量由试剂盒厂商（如 NEB HiFi Assembly）给出，通常每个片段 0.02–0.5 pmol，与 T4 连接酶逻辑不同，请参考对应产品手册。
连接后转化效率很低，是摩尔比的问题吗？
摩尔比只是因素之一。还需排查：① 连接缓冲液中 ATP 是否降解（缓冲液反复冻融后 ATP 易失活，建议分装保存）；② 载体是否线性化完全；③ DNA 末端是否平整（PCR 产物建议用高保真酶并补加 Taq 加 A 尾，或末端补平处理）；④ 感受态细胞效率。
计算结果显示 insert 用量超过了我现有的 DNA 量，怎么办？
可以选择：① 减少载体用量（等比例缩小整个体系）；② 提高 insert 浓度（乙醇沉淀浓缩）；③ 降低摩尔比至 2 : 1（对高效黏性末端仍可接受）；④ 扩大反应总体积至 20 µL，保持摩尔数不变，但转化时取全量电转或取 5 µL 化转。