蛋白质净电荷计算器（pH 依赖性）
Henderson-Hasselbalch 方程与蛋白质净电荷
蛋白质上存在多种可电离基团：N 末端 α-氨基（碱性）、C 末端 α-羧基（酸性），以及 Asp、Glu、His、Cys、Tyr、Lys、Arg 七种侧链。在给定 pH 下，每个基团的带电比例由 Henderson-Hasselbalch 方程决定。
碱性基团（N 末端、His、Lys、Arg；质子化后带 +1 电荷）：
f(+) = 1 / (1 + 10^(pH − pKa))
酸性基团（C 末端、Asp、Glu、Cys、Tyr；去质子化后带 −1 电荷）：
f(−) = 10^(pH − pKa) / (1 + 10^(pH − pKa))
若某基团共有 n 个残基，其净电荷贡献为 +n·f(+)（碱性）或 −n·f(−)（酸性）。对全部基团求和即得理论净电荷：
Z(pH) = Σ(碱性: +n · f(+)) + Σ(酸性: −n · f(−))
等电点（pI）是使 Z = 0 的 pH，本工具用二分法在 pH 0–14 内自动搜索。
各基团 pKa 参考值
本工具用的是 EMBOSS iep 的 pKa 取值，和站上的
蛋白质分子量 / 等电点计算器 用的是同一套——
同一个站的两个工具对同一组基团给出不同的数，读者没法知道该信哪个
（对齐之前两边对胰岛素 A 链算出的 pI 分别是 3.40 和 3.61）。
出处：EMBOSS iep 文档。
| 基团 | 类型 | pKa |
|---|---|---|
| N 末端（α-NH₂） | 碱性 | 8.6 |
| C 末端（α-COOH） | 酸性 | 3.6 |
| Asp（D），β-COOH | 酸性 | 3.9 |
| Glu（E），γ-COOH | 酸性 | 4.1 |
| His（H），咪唑基 | 碱性 | 6.5 |
| Cys（C），巯基（游离） | 酸性 | 8.5 |
| Tyr（Y），酚羟基 | 酸性 | 10.1 |
| Lys（K），ε-NH₂ | 碱性 | 10.8 |
| Arg（R），胍基 | 碱性 | 12.5 |
注：Arg 的 pKa（12.5）远超生理 pH 范围，在 pH 4–12 内实际上始终带 +1 电荷（f(+) > 0.9999）。
不同来源的 pKa 标度差别不小，这会直接改变结果，必须说清楚。 ExPASy 的 Compute pI/Mw 用的是 Bjellqvist 等人从固相 pH 梯度电泳迁移位置 反推出来的经验标度（Bjellqvist B, Hughes GJ, Pasquali C 等， Electrophoresis 1993;14:1023-31，PMID: 8125050），它的侧链值与上表逐项不同 （例如 His 约 5.98 对本表的 6.5、Lys 约 10.0 对 10.8、Arg 约 12.0 对 12.5），而且 N 末端还按首位残基取不同值。 差别有多大可以直接算：pH 7.4 下 His 按 pKa 6.5 得 f(+) = 0.1118， 按 5.98 得 0.0366，相差约 3 倍。所以—— 本工具的数值不会和 ExPASy 逐位对齐，富含 His 的蛋白差得最明显； 要和已发表的 pI 对比，请先确认对方用的是哪套标度。 本工具的定位是方向性判断（见下方「适用范围」），不是替代 ExPASy 的精确复现。
适用范围与常见错误
适用情形：线性肽段与折叠蛋白质的方向性判断——用哪种 IEX 填料、在哪段 pH 下蛋白质带什么符号的电荷。
不适用或需额外注意： - 折叠蛋白质的精确电荷：疏水内核中的 His pKa 有时低至 4，Cys 紧邻正电荷时 pKa 可降至 6，偏移因结构而异，本工具无法反映。 - 翻译后修饰：每个磷酸化位点在生理 pH 下额外贡献 −1 至 −2 电荷；O-糖基化对净电荷影响有限，但磷酸化需手动校正。 - 二硫键：已配对的 Cys 巯基不再电离，务必填入正确的二硫键数量。
最常见操作错误：仅凭 pI 就决定沉淀条件。净电荷为零（pI 处）是静电排斥消失的必要条件，但聚集驱动力来自疏水相互作用，两者独立。IEX 结合通常要求|Z| ≥ 2，且工作 pH 与 pI 相差 1 个单位以上。
可以验算的算例
缓激肽（Bradykinin，RPPGFSPFR，9 个氨基酸）
序列里只有 2 个 Arg，没有 Asp/Glu/His/Cys/Tyr/Lys，所以只剩三项。 在 pH = 7.4 下逐项计算：
N 末端（碱性，pKa 8.6） f(+) = 1 / (1 + 10^(7.4 − 8.6)) = +0.941
Arg × 2（碱性，pKa 12.5）f(+) = 1 / (1 + 10^(7.4 − 12.5)) = +2.000
C 末端（酸性，pKa 3.6） f(−) = 10^(7.4 − 3.6) / (1 + 10^(7.4 − 3.6)) = −1.000
Z = +0.941 + 2.000 − 1.000 = +1.94（这四个数就是工具会显示的）
缓激肽 pI ≈ 12.5（由两个 Arg 主导），在 pH 7.4 下净电荷约 +1.9，在 CEX 柱上有效保留、不上 AEX——与文献报道的行为一致。
常见问题
这个净电荷和实验测定值一样吗？
不一定。折叠蛋白质中侧链 pKa 受局部微环境影响可偏移 ±2 以上：埋藏在疏水核心的 His 有时低至 4，表面 Asp 可接近自由氨基酸值 3.9。本工具给的是展开态模型肽估算，适合方向性判断（选 AEX 还是 CEX、pI 大致在哪段 pH 内），不能替代滴定实验。
如何用计算结果选离子交换树脂？
在工作 pH 下 Z < 0（负电荷）→ 选阴离子交换（AEX，正电填料）；Z > 0（正电荷）→ 选阳离子交换（CEX，负电填料）。|Z| 越大，结合越稳定、选择性越明确。通常建议工作 pH 与 pI 相差至少 1 个单位，以保证足够的静电结合力。
为什么我的蛋白质在理论 pI 附近不沉淀？
净电荷为零只是蛋白质聚集的必要条件，并非充分条件。蛋白质聚集还受疏水相互作用、盐浓度与蛋白质浓度影响。部分高疏水性蛋白在远离 pI 处就已聚集；另一些蛋白在 pI 处溶解性反而良好。本工具可帮你定位 pI 的 pH 区间，沉淀摸索仍需实验验证。
二硫键中的 Cys 该怎么处理？
氧化态 Cys（已配对成二硫键）的巯基不再电离，不贡献净电荷。填入已知的二硫键数量后，工具会从 Cys 总计数中减去 2×n_SS 个残基再参与计算。还原性 DTT 处理后的蛋白质所有 Cys 均游离，填 0 即可。