TCID₅₀ 感染滴度计算器（Reed-Muench 累积法）

方法原理

TCID₅₀（50% 组织培养感染剂量，Tissue Culture Infective Dose 50）由 Reed 和 Muench 于 1938 年提出（Am J Hyg 27:493-497）。它的定义是：某一接种量的病毒液恰好使 50% 的实验孔或动物出现感染终点时，所对应的病毒浓度。终点可以是细胞病变效应（CPE）、荧光、死亡等任何可判读的二元结果。

Reed-Muench 累积法四步走

对病毒原液做系列稀释，每个稀释度接种若干孔，观察并记录各稀释度「阳性孔数/总孔数」。

第一步：累积计数

阳性数从最稀的行开始向上（向浓的方向）逐行累加；
阴性数从最浓的行开始向下（向稀的方向）逐行累加。

感染率% = 累积阳性 / (累积阳性 + 累积阴性) × 100

第二步：定位跨越 50% 的相邻两行

找到感染率刚好高于 50% 的稀释度（称为 A，感染率记为 a%）和相邻更稀一级（称为 B，感染率记为 b%）。

第三步：计算比例距（Proportionate Distance, PD50）

PD50 = (a - 50) / (a - b)

PD50 的值域为 0 到 1，表示 50% 感染点在 A、B 两行之间的相对位置。

第四步：求滴度

d50 = log10(稀释度_A) - PD50 × log10(稀释倍数)

log10(TCID50/mL) = -d50 - log10(接种体积_mL)

接种 100 µL 即 0.1 mL 时，log10(0.1) = -1，所以 log10(TCID50/mL) = -d50 + 1。

可验证算例

以下数据：10 倍稀释、起始 10⁻¹、每稀释度 4 孔、每孔接种 100 µL：

稀释度   阳性/总孔
10⁻¹    4/4
10⁻²    4/4
10⁻³    3/4
10⁻⁴    1/4
10⁻⁵    1/4
10⁻⁶    0/4

累积后各稀释度感染率依次为：100%、100%、83.3%、33.3%、12.5%、0%。

跨越 50% 的相邻两行：10⁻³（83.3%）和 10⁻⁴（33.3%）。

PD50   = (83.3 - 50) / (83.3 - 33.3) = 33.3 / 50 = 0.667
d50    = -3 - 0.667 × 1 = -3.667
log10(TCID50/mL) = 3.667 - log10(0.1) = 3.667 + 1 = 4.667

结果：约 4.6 × 10⁴ TCID₅₀/mL。

适用边界

• 稀释间隔必须恒定：计算假设每相邻两行相差同一个 log₁₀ 值（等比稀释）。跳跃稀释或不规则间隔会使 PD50 乘数出错。
• 每稀释度总孔数必须相同：若某孔污染需剔除，需在输入前手动处理，工具不做不等权重的加权。
• 系列内必须同时存在 > 50% 和 < 50% 的相邻稀释度：全阳或全阴均无法在已有数据内插值，应扩大稀释范围后重做实验。
• 本工具给出的是统计估计，不是精确计数：低重复数（≤2 孔/稀释度）时置信区间很宽，不适合作为精确定量依据，建议同时参考 PFU 法。

常见错误

1. 累积方向搞反：阳性从稀到浓方向累积，阴性从浓到稀方向累积，方向不能互换——这是手算最高频的错误。
2. 忘记折算接种体积：100 µL 与 200 µL 的滴度相差 log₁₀2 ≈ 0.3 个对数单位；漏算这步会带来系统性偏差。
3. 对全程单调的数据强行插值：若所有稀释度感染率均 > 50% 或均 < 50%，不存在有效的 A/B 组合，不应给出结果。
4. 混淆 TCID₅₀ 与 LD₅₀：两者算法完全相同，但 LD₅₀ 的终点是动物死亡，单位和解释截然不同，报告时务必明确。