酶切体系配制计算器（单位用量、甘油上限与配比）
按活力单位的定义算一算：1 µg DNA 需要 1 个单位，而常见的酶是 20 U/µL—— 0.05 µL。这个体积根本没法移液。
所以实际操作里人人都加 1 µL，也就是 20 倍过量。酶量从来不是问题， 真正卡住你的是那 1 µL 里带进来的甘油。
三条式子
需要的单位数 = DNA 量(µg) × 每 µg 所需单位
酶体积(µL) = 单位数 ÷ 酶浓度(U/µL)
终体系甘油(%) = 酶体积 ÷ 反应总体积 × 50%
最后一条里的 50% 是酶储存液的甘油含量（常见值）。 把它反过来解就得到那条人人都听过、却很少有人知道出处的规矩：
酶体积不得超过反应总体积的 10%——因为 10% × 50% = 5%， 而 5% 正是甘油开始引起特异性下降和星号活性的线。
每 µg 需要多少单位
| 底物 | 常用值 | 为什么 |
|---|---|---|
| λ DNA / 纯化的线性片段 | 1 U/µg | 这就是单位的定义本身 |
| 超螺旋质粒（单切点） | 1–20 U/µg | 超螺旋构象更难切 |
| 基因组 DNA | 10 U/µg 起 | 位点多、杂质多，通常还要过夜 |
这三档不是随便定的：活力单位的定义用的底物就是 λ DNA， 所以 1 U/µg 只对「和 λ 一样好切」的底物成立。 质粒的超螺旋构象、以及一个质粒上要切的位点总数，都会把需要的单位数推上去。
星号活性不会报错
甘油超标的表现不是「切不动」，是切了不该切的地方—— 凝胶上多出几条带，而你多半会去怀疑酶失活、DNA 降解或者位点预测错了。 这就是为什么这个工具把甘油单列出来算：它和用量无关， 却是酶切结果诡异时最该先排查的一项。
双酶切要特别注意：两个酶的甘油是叠加的。 各加 1 µL 到 20 µL 体系里就是 10%，正好翻倍超线。
孵育多久
- 常规反应：1–4 小时。
- 基因组 DNA：4 小时到过夜。
- 过夜之前先查这个酶的过消化值：低于 12 U/16 h 的酶不适合过夜， 长时间高单位下有星号活性风险。
体系怎么配
10× 缓冲液占总体积的 1/10，剩下的是 DNA、酶和水。 本工具会把四项都算出来，并检查装不装得下—— DNA 浓度太稀时，光 DNA 就能把体系占满，这时要么先浓缩 DNA，要么放大体系。
这个工具不管什么
- 缓冲液兼容性。双酶切能不能同缓冲液、哪个厂商的几号 buffer， 各家不同且时有更新，请查厂商的双酶切工具。
- 甲基化敏感性。Dam/Dcm 甲基化会挡住某些酶，与用量无关。
- 热失活条件。各酶不同，查说明书。
相关工具
找切点与识别序列见 限制酶速查； DNA 浓度由 OD₂₆₀ 换算见 核酸浓度换算； 切完之后要连接的摩尔比见 DNA 连接计算。
单位定义、甘油上限与质粒所需单位数取自 Promega 公开的限制酶使用指南。
常见问题
一个活力单位到底是多少？
一个单位是指在合适的缓冲液与温度下、**1 小时内完全消化 1 µg DNA** 所需的酶量，标准底物是 λ DNA。这个定义有个实际后果很少被点破：1 µg DNA 只需要 1 U，而常见的酶是 20 U/µL，算出来是 0.05 µL——根本没法移液。所以实际操作里人人都加 1 µL，也就是 20 倍过量。酶量从来不是瓶颈，甘油才是。
为什么酶体积不能超过体系的 10%？
因为酶储存液是 50% 甘油，而终体系甘油高于 5% 时部分酶会出现特异性下降、也就是星号活性。10% × 50% = 5%，那条「不超过 10%」的规矩就是这么来的。本工具直接把终体系甘油算出来，因为真正决定它的是**酶体积占体系的比例**，和加了多少单位无关。
甘油超标会有什么表现？
不是切不动，是**切了不该切的地方**——凝胶上多出几条预期之外的带。麻烦就在这里：这个表现看起来像酶失活、DNA 降解或者位点预测错了，很少有人第一时间想到甘油。所以酶切结果诡异时，先算一下这个数。
质粒为什么要比 λ DNA 多给单位？
活力单位的定义用的底物就是 λ DNA，所以 1 U/µg 只对「和 λ 一样好切」的底物成立。质粒是超螺旋构象，本身更难切，加上一个质粒上要切的位点总数，单切点的超螺旋质粒常常需要 1–20 U/µg。基因组 DNA 位点多、杂质多，通常 10 U/µg 起步并延长到过夜。
双酶切要注意什么？
**两个酶的甘油是叠加的**。20 µL 体系里各加 1 µL 就是 10% 体积、5% 甘油，正好压在线上，再多一点就超。要么放大体系，要么换更高浓度的酶。另外缓冲液兼容性是另一件事，本工具不管——请查厂商的双酶切工具。
能过夜吗？
常规反应 1–4 小时就够，基因组消化通常 4 小时到过夜。要过夜的话先查这个酶的**过消化值**：低于 12 U/16 h 的酶不适合过夜，长时间高单位下有星号活性风险。换句话说「多切一会儿更保险」并不总是成立。