细胞划痕实验分析计算器：伤口愈合率与迁移速率
方法原理
细胞划痕实验（scratch wound healing assay，也称 in vitro wound healing assay）是评价细胞二维迁移能力最经济、最常用的体外方法之一。Liang 等（2007，PMID 17406593）系统化描述了其操作规范：在近融合的单层细胞上用移液枪头垂直划出一条“伤口”，去除碎屑后加入新鲜培养基，在同一位置定时拍摄相差显微镜图像，通过划痕宽度变化量化细胞前沿的迁移过程。
核心公式
伤口愈合率（% wound closure）：
愈合率 (%) = (W₀ − Wₜ) / W₀ × 100%
W₀ 为 t = 0 时的初始划痕宽度（µm），Wₜ 为终点时刻宽度。用相对变化而非绝对宽度缩小量，是因为不同孔的初始划痕宽度因操作力度不同可相差 20–30%；百分比指标已将该差异除掉，使不同条件间的比较更加公平。
每侧前沿迁移速率：
速率 (µm/h) = (W₀ − Wₜ) / (2 × Δt)
划痕两侧的细胞同时向中央迁移，宽度缩小量是两侧位移之和。假设左右对称，单侧前沿的实际位移为 (W₀ − Wₜ)/2，因此速率需除以 2。省略 2 则得到整条缝的闭合速率，数值翻倍，不能与 Transwell 或单细胞追踪的迁移速度直接比较。
多复孔统计：
对同一处理组的 n 个平行孔，先对每孔独立计算 % 愈合率，再求均值与样本标准差：
x̄ = Σ closure_i / n
SD = sqrt( Σ(closure_i − x̄)² / (n − 1) )
适用范围
本工具针对单一终点时间点的宽度法数据（t = 0 对比 t = 终点）。典型划痕宽度约为 200–700 µm（10× 物镜），时间跨度 12–48 h。面积法（需图像分析软件测量空白面积）与宽度法公式形式相同，将 W 替换为面积 A 后同样适用。
划痕实验的闭合过程包含迁移和增殖两个成分，二者无法由本公式区分。若实验目的是单独量化迁移，需用丝裂霉素 C 预处理抑制增殖；否则所得指标应描述为「伤口愈合能力」，不等同于「迁移能力」。
常见错误
1. 不同孔使用同一个 W₀ 归一化
操作误差导致各孔初始宽度并不相同。若用组平均 W₀ 代替每孔自身 W₀，当两组初始宽度本身存在系统差异时，愈合率的组间差异有一部分来自初始宽度而非真实迁移差异。应始终用各孔配对的 W₀ᵢ 计算各自的 % 愈合率，再合并统计。
2. 拍摄位置未固定
同一孔内不同位置的划痕宽度差异可达数十微米。须在孔底用记号笔标记至少 3 个固定位置（或使用带网格培养皿），每次拍摄同一标记点，并在同一时间点测量 3–5 条平行线取均值后再参与统计，否则组内变异会掩盖组间差异。
3. 终点时间过长、速率不再线性
愈合早期（0–12 h）前沿速率通常接近恒定，可用本工具的公式可靠地计算平均速率；24–48 h 后，两侧前沿接触或细胞密度升高后接触抑制开始起作用，速率往往减慢。若需要量化速率而非仅报告终点愈合率，应增加 6–12 h 的中间时间点，分段计算。
可以验算
以下用例可手算核对工具输出：
单孔，终点单时间点 - W₀ = 500 µm，Wₜ = 150 µm，Δt = 24 h - 愈合率 = (500 − 150) / 500 × 100% = 70.00% - 每侧前沿速率 = (500 − 150) / (2 × 24) = 350 / 48 = 7.29 µm/h
零愈合对照 - W₀ = 400 µm，Wₜ = 400 µm → 愈合率 = 0.00%，速率 = 0.00 µm/h
三复孔（验算均值与 SD） - W₀ = 500、490、510 µm；Wₜ = 150、145、160 µm；Δt = 24 h - 各孔愈合率：(500−150)/500 × 100 = 70.00%；(490−145)/490 × 100 = 70.41%；(510−160)/510 × 100 = 68.63% - 均值 = (70.00 + 70.41 + 68.63) / 3 = 69.68% - 各孔速率：350/48 = 7.29、345/48 = 7.19、350/48 = 7.29 µm/h；均值 = 7.26 µm/h
常见问题
为什么计算迁移速率要除以 2？
划痕两侧的细胞同时向中央移动，测量宽度的缩小量是左右两侧位移之和。若假设两侧对称迁移，单侧前沿实际位移 = (W₀ − Wₜ)/2，速率 = (W₀ − Wₜ)/(2Δt)。不除以 2 报告的是整条缝的闭合速率，无法直接与单细胞追踪或 Transwell 穿孔实验的迁移数据比较。
为什么建议用丝裂霉素 C 预处理？
划痕闭合由迁移和细胞增殖共同贡献。若实验目的是单独评估迁移能力，应在划痕前 2 h 加入丝裂霉素 C（约 10 µg/mL，处理 2 h）以抑制增殖，各组同等处理。不抑制增殖时，应将结果描述为「伤口愈合能力」而非「迁移能力」，两者不可混用。
为什么要用各孔自己的 W₀ 而不是各组平均 W₀ 归一化？
操作误差使不同孔的初始划痕宽度可相差 20–30%。用每孔自身的 W₀ 做分母，% 愈合率已自动抵消该差异；若改用组平均 W₀，当两组初始宽度本身不同时会引入系统性偏差。本工具对每一对（W₀ᵢ，Wₜᵢ）独立计算，再汇总均值和标准差。
面积法和宽度法哪个更准确？
面积法（用 ImageJ 等勾勒空白区）更能处理划痕边缘不规则或细胞分布不均的情况，是更严格的报告方式。宽度法更快，适用于划痕较直、宽度均一的场景。两种方法的公式形式完全相同（将 W 替换为面积 A 即可），本工具均可使用，只需保持单位在同一实验内统一。
结果超过 100% 应如何处理？
若 Wₜ 极小（接近 0）或存在测量误差，% 愈合率会略超 100%。报告时记录为「完全愈合（≥ 100%）」并保留原始宽度值；若多个孔系统性超过 110%，说明增殖贡献显著或观测时间过长，建议缩短终点时间或增加丝裂霉素 C 对照组加以甄别。