ChIP-qPCR 百分比输入法计算器（% Input 富集分析）
什么是 ChIP-qPCR 百分比输入法（% Input Method）
染色质免疫共沉淀（ChIP，Chromatin Immunoprecipitation）实验中，最广泛使用的定量方式是将免疫沉淀（IP）回收的 DNA 量，表示为实验起始总染色质的百分比，即 % Input。相比 Fold Enrichment over IgG，% Input 保留了绝对富集信息；相比原始 Ct 差值，它统一了不同 Input 保留比例带来的系统偏差，是目前多数期刊认可的报告方式。
核心公式
实验通常在免疫沉淀前取出一小部分染色质（比例 F，例如 1% input 时 F = 0.01）作为 Input 参照，与 IP 组平行进行 qPCR 检测。
设： - F = 保存的 Input 比例（小数，例如 1% input 填 1，此处 F = 0.01） - CT_Input = Input 管的 Ct 值 - CT_IP = 免疫沉淀管的 Ct 值
则：
% Input = F × 2^(CT_Input − CT_IP) × 100%
文献中还有一种等价写法，先将 Input Ct 折算至“假想的 100% Input”后再计算：
CT_adjusted = CT_Input − log2(1/F)
% Input = 2^(CT_adjusted − CT_IP) × 100%
两种写法数学上完全一致，代入展开即互相转化。
公式推导
qPCR 中，模板量与 Ct 值满足：
模板量 ∝ 2^(−Ct)
因此：
DNA_IP / DNA_Input = 2^(CT_Input − CT_IP)
IP DNA 占总染色质（DNA_total）的比例：
% Input = (DNA_IP / DNA_total) × 100%
= (DNA_IP / (DNA_Input / F)) × 100%
= F × (DNA_IP / DNA_Input) × 100%
= F × 2^(CT_Input − CT_IP) × 100%
适用边界
- 公式假设 qPCR 扩增效率 E = 2.0（每循环恰好翻一倍）。效率在 90%–110% 范围内，误差通常可接受。若怀疑扩增效率偏离，应先用标准曲线法（本站 qPCR 扩增效率工具）评估，再决定是否用 Pfaffl 方程做效率校正。
- Ct 值须落在 qPCR 线性扩增区（通常 15–35 循环）。Ct > 35 的结果噪声主导，不应纳入计算。
- Input 保留比例建议 1%–5%。比例越低，Input 管 Ct 越高、越接近扩增上限，统计方差越大。
关于 IgG 对照与 Fold Enrichment over IgG
非特异性 IgG 对照的 % Input 代表背景结合水平。在此基础上可进一步计算：
Fold Enrichment over IgG = % Input_目标抗体 / % Input_IgG
这个指标消除了批次间非特异性差异，适合跨实验比较。本工具在 CT_IgG 列有输入时自动给出。
常见错误
-
忘记乘以 Input 比例 F：直接用 2^(CT_Input − CT_IP) 作为 % Input，结果比真值高 1/F 倍——1% input 时虚高 100 倍，5% input 时虚高 20 倍。这是 ChIP 定量中最常见的错误。
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先平均 Ct 值再计算：Ct 是对数尺度，对 Ct 值直接求均值等于对模板量做几何平均。应先对每个重复计算 % Input，再对线性值做统计。
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Input 保留比例前后不一致：同一项目不同批次用了不同 F 值，直接比较 % Input 无效，需用各自真实的 F 重新计算。
-
用 ΔΔCt 代替 % Input：ΔΔCt（本站 ddCt 工具）适用于基因表达相对定量，依赖“参照基因稳定表达”假设；ChIP 没有等价的“管家位点”，不能套用该框架。
可验证算例
下列算例使用 1% input（F = 0.01），CT_Input = 19.5，所有 Ct 值均在 15–35 线性区内：
| 位点 | CT_IP | % Input | 手算验证 |
|---|---|---|---|
| 启动子（H3K4me3 强富集区） | 16.0 | 11.3% | 0.01 × 2^3.5 × 100 = 0.01 × 11.31 × 100 |
| 基因间区（阴性对照区） | 23.0 | 0.088% | 0.01 × 2^(−3.5) × 100 = 0.01 × 0.0884 × 100 |
Fold enrichment（启动子 / 阴性区）= 11.3% / 0.088% ≈ 128×，与 H3K4me3 在活跃启动子区的文献报道量级（50–200×）吻合。
2^3.5 = 2^3 × 2^0.5 = 8 × 1.414 = 11.31，可心算核对。
常见问题
为什么要乘以 Input 比例（F）？
实验中只保留了 1%（F = 0.01）的总染色质作为 Input，其 Ct 值比假想的「100% Input」高约 6.6 个循环。不乘 F 会让 % Input 整体虚高 100 倍——这是 ChIP 定量里最常见的单数量级错误。
% Input 和 Fold Enrichment over Input 有什么区别？
Fold Enrichment over Input（不校正稀释）= 2^(CT_Input − CT_IP)，是 IP 相对于「当前这管已稀释 Input」的倍数。% Input 在此基础上乘以 F，反映 IP DNA 占总投入染色质的真实比例。两者相差 input_pct 倍（1% input 时数值相等，5% input 时 % Input = 5 × Fold）。
何时加 IgG 对照？
IgG（非特异性抗体）的 % Input 代表背景结合量。用目标抗体 % Input 除以 IgG % Input 得到 Fold Enrichment over IgG，可消除不同批次间的非特异吸附差异，跨实验比较时更可靠。
多个技术重复的均值该怎么算？
先对每个重复单独计算 % Input（线性量），再对这些线性值求均值和标准差，最后做统计检验。不要先对 Ct 值取平均再代入公式——Ct 是 log₂ 尺度，直接平均在数学上没有意义。
Ct 值多少算可靠？
通常 Ct 15–35 处于 qPCR 线性扩增区，结果可信。Ct > 35 接近背景荧光噪声，建议废弃。如果 Input 管 Ct > 30，说明保留量过少，可提高 Input 比例至 2%–5% 重做。