DNA / RNA 拷贝数在线计算（质粒标准品、qPCR、ddPCR）

由浓度和长度算出每微升拷贝数、每管拷贝数与单拷贝质量，并生成标准曲线稀释方案。

浓度 (ng/µL)

长度 (bp 或 nt)

每单位分子量

每反应加样体积 (µL)

目标浓度 (copies/µL)

标准曲线点数

每点稀释倍数

做 qPCR 绝对定量要先有一条标准曲线，而标准曲线的横坐标是拷贝数，不是浓度。两者之间的换算只有一步——把质量换成分子数：

拷贝数/µL = 浓度(ng/µL) × 10⁻⁹ × 6.022×10²³ / (长度 × 每单位分子量)

10⁻⁹ 是 ng 转 g，6.022×10²³ 是阿伏伽德罗常数。

每单位分子量取多少，是这个计算里唯一有争议的地方：

650 与 660 之间差约 1.5%，在拷贝数上就是 1.5% 的系统偏差。 同一个项目里必须自始至终用同一个值，否则不同批次的标准曲线之间无法比较。

需要提醒的是：本站的核酸浓度换算工具在 ng↔pmol 换算里用的是 660，因为那是 pmol 换算的通行惯例；而拷贝数计算的通行惯例是 650。这两个惯例确实不一致，本工具默认 650 并允许你改，选哪个都请在项目里保持一致。

比常数更容易出错的三件事：

长度要用整条模板的长度。 质粒标准品要算整个质粒的长度（骨架 + 插入片段），不是扩增子长度——你稀释的是完整质粒分子。只有当模板是纯 PCR 产物时才用扩增子长度。
线性化不改变拷贝数，但会改变扩增效率。 环状超螺旋质粒作标准品会低估拷贝数（扩增效率低于线性模板），做绝对定量前应先酶切线性化。
标准品浓度必须用荧光染料法测（Qubit/PicoGreen），不要用 A260。 A260 会把游离核苷酸和 RNA 一起算进去，直接抬高你算出的拷贝数。

低拷贝端还有泊松分布的限制：稀释到平均每管 1 个拷贝时，约 37% 的管子里其实一个都没有。标准曲线最低点建议不低于每反应 10 拷贝。

常见问题

填质粒全长（骨架加插入片段）。你稀释的是完整质粒分子，每个分子只贡献一个拷贝。只有模板是纯化的 PCR 产物时才填扩增子长度。

拷贝数计算的通行惯例是 650（NCBI、URI），部分厂商计算器用 660。两者差约 1.5%。选哪个都行，但同一个项目必须自始至终用同一个值，否则不同批次的标准曲线无法比较。

环状超螺旋质粒的扩增效率低于线性模板，直接用会低估拷贝数。线性化不改变分子数，但让扩增效率与待测样本可比。

建议不低于每反应 10 个拷贝。再低受泊松分布支配——平均 1 拷贝/管时约 37% 的管子是空的，重复孔之间会出现无法解释的跳动。