Gibson 无缝组装片段用量计算器（多片段摩尔比与 pmol 换算）
做 Gibson 组装时最常见的问题不是「配比是多少」，而是片段数变了配比也得跟着变—— 而且变的方向和直觉相反。
两套推荐量
NEB 公开的 NEBuilder HiFi 反应协议把它分成两档：
| 2–3 个片段 | 4–6 个片段 | |
|---|---|---|
| 载体 : 插入片段（摩尔比） | 1 : 2 | 1 : 1 |
| 片段总量 | 0.03–0.2 pmol | 0.2–0.5 pmol |
| 反应条件 | 50 °C，15 分钟 | 50 °C，60 分钟 |
| 同源臂长度 | 15–20 bp | ≥ 20 bp |
注意这两列的方向：片段多了，插入片段的过量倍数反而从 2 倍降到 1 倍， 而片段总量提高了近一个数量级。原因不难理解——片段越多， 正确连接的组合数越少、错配的机会越多，这时候让各片段等摩尔比让某一个过量更有利； 而总量提上去是为了补偿效率随片段数下降。
协议还给了一条经验值：以 50–100 ng 载体、插入片段 2 倍过量时克隆效率最优。
换算公式
pmol = ng × 1000 ÷ (bp × 650)
650 道尔顿是双链 DNA 每个碱基对的平均分子量。
可以验算：协议自己给了两个数——50 ng 的 5000 bp dsDNA 约 0.015 pmol， 50 ng 的 500 bp dsDNA 约 0.15 pmol。代进上式分别得 0.01538 和 0.1538，对得上。 本工具用的就是这条式子。
两条容易漏掉的硬规则
小于 200 bp 的片段要多加 5 倍。 短片段在反应里更容易丢， 按摩尔比算出来的量往往不够。协议明确写了这一条，本工具会自动标出来。
未纯化的 PCR 产物总体积不能超过反应体系的 20%。 20 µL 体系里就是 4 µL。 PCR 缓冲液里的成分会抑制组装——这一条和用量无关，却经常是失败的真正原因。
反应体系
标准 20 µL 体系：Master Mix 10 µL + 片段 X µL + 水补到 20 µL。 片段数多到装不下时，协议说的是放大反应体积并相应增加 Master Mix， 而不是硬挤——浓度不够就先浓缩片段，不要靠减少载体用量腾体积。
什么时候这套数不适用
- 这是无缝组装（依赖片段末端的同源臂）的推荐量。 黏端 / 平端的 T4 连接酶克隆是另一套，见 DNA 连接摩尔比。
- 片段超过 6 个、或单片段超过几十 kb 时，上表不再覆盖， 通常要分轮组装而不是一锅。
- 同源臂本身的设计（长度、Tm、避免二级结构）不在本工具范围内， 它只算用量。
相关工具
黏端/平端连接的摩尔比见 DNA 连接计算； 片段浓度由 OD₂₆₀ 换算见 核酸浓度换算； 拷贝数与单拷贝质量见 DNA 拷贝数。
方法原文：Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3rd, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods 2009;6(5):343–345（PMID 19363495）。 用量与反应条件取自 NEB 公开的 NEBuilder HiFi DNA Assembly 反应协议。
常见问题
片段数变多，为什么插入片段的过量倍数反而要降下来？
因为片段越多，能够错配的组合就越多。2–3 个片段时让插入片段 2 倍过量，可以把载体自连压下去；到 4–6 个片段时，任何一个片段过量都会增加它自己首尾相接或插到错误位置的机会，这时**等摩尔**更有利。所以摩尔比从 1:2 变成 1:1——但片段总量要从 0.03–0.2 pmol 提到 0.2–0.5 pmol，补偿效率随片段数的下降。两件事方向相反，很容易记混。
ng 和 pmol 怎么换算？怎么确认算得对？
pmol = ng × 1000 ÷ (bp × 650)，650 道尔顿是双链 DNA 每个碱基对的平均分子量。验算方法是拿协议自带的两个算例对一遍：50 ng 的 5000 bp dsDNA 约 0.015 pmol，50 ng 的 500 bp dsDNA 约 0.15 pmol。代进式子分别是 0.01538 和 0.1538，对得上。
很短的片段为什么要多加？
小于 200 bp 的片段在反应和后续纯化里损失比例更高，按摩尔比算出来的量往往不够。协议给的经验是这类片段用 5 倍量。本工具会自动识别并标出来——这一条最容易漏，而漏掉的表现通常不是完全失败，是克隆数明显偏少。
为什么未纯化的 PCR 产物有体积上限？
PCR 缓冲液里的成分（尤其是残留的引物、dNTP 和聚合酶缓冲盐）会抑制组装反应。协议规定未纯化片段的总体积不得超过反应体系的 20%，20 µL 体系里就是 4 µL。这一条和用量完全无关，却经常是失败的真正原因——用量算得再准，体积超了照样不长。
这套数和 T4 连接酶克隆通用吗？
不通用。这里给的是**无缝组装**（靠片段末端的同源臂）的推荐量，黏端/平端的 T4 连接酶克隆是另一套体系和另一套比例，站上有单独的 [DNA 连接计算](../ligation-calc/)。两者不要互相套用。
片段超过 6 个怎么办？
协议的两档只覆盖到 6 个片段，再多就不在推荐范围内了。常规做法是分轮组装：先把几个片段拼成中间产物，纯化后再进行下一轮，而不是一锅全放。一锅放太多片段时，正确组合的比例会迅速下降。