DNA 序列 GC 含量与 Tm 值在线计算

GC 含量决定双链的稳定性：G-C 之间三个氢键，A-T 只有两个，所以 GC 越高，解链温度越高。 引物设计一般把 GC% 控制在 40–60%。

Tm（解链温度）这里给两个经验公式，它们的适用长度不同，别用错：

• Wallace 规则，适用于 14 nt 以下的短寡核苷酸： Tm = 2×(A+T) + 4×(G+C)
• GC 经验公式，适用于约 14–50 nt： Tm = 64.9 + 41×(G + C − 16.4) / N

需要说清楚的是：这两个都是经验估算，没有考虑盐浓度、引物浓度和最近邻热力学参数。 真要定 PCR 退火温度，请用 最近邻法 Tm 计算器，或直接做梯度 PCR。 本工具的定位是快速筛掉明显不合格的候选序列。

分子量按单链计算，同时给出两个值：含 5′ 磷酸的形式，等于各残基质量之和再加一个水分子； 以及 5′-OH 的形式，比前者少一个 HPO₃（79.98）。 合成公司发来的引物默认是 5′-OH，订购单上 μg 与 nmol 的换算用的是后一个值。 拿到引物后要配多少体积的母液，见 引物复溶与稀释计算器。

两个公式差多少：一个真实例子

20 nt 引物 GCATCGATCGATCGATCGAT，GC 含量正好 50%：

Wallace 规则    60.0 °C
GC 经验公式     51.8 °C

差了 8.2 °C。 退火温度通常取 Tm 减 5 °C 左右，这个差距足以决定 一次 PCR 是特异扩增还是满板杂带。

为什么 Wallace 偏高

Wallace 规则给出的估计对应的是高盐环境下、一条链被固定的情形（约 0.9 M 盐）。 实际 PCR 里两条链都在溶液中、盐浓度低得多，真实 Tm 比 Wallace 值约低 7–8 °C—— 这正好解释了上面那个差距。

所以：Wallace 适合心算筛选，不适合定退火温度。

真正该用的方法

定 PCR 条件请用最近邻热力学模型（nearest-neighbor，SantaLucia 参数集）。 它考虑相邻碱基的堆积作用、引物浓度、盐浓度与二价镁离子， 是各家引物设计软件和厂商 Tm 计算器的实际算法。 本站的 最近邻法 Tm 计算器 就是做这个的；本工具不做， 因为它需要一整套实验测定的热力学参数表，且结果强烈依赖你实际的反应体系。

本工具的定位是快速筛掉明显不合格的候选序列：GC 太高太低、长度不对、组成极端。 选定候选之后，用厂商计算器或直接做梯度 PCR 定退火温度。

GC 含量之外，引物还要看什么

• 3′ 端最后 5 个碱基里有 1–2 个 G/C（GC clamp），有助于结合牢固； 但连续 3 个以上 G/C 反而容易错配延伸。
• 避免单碱基连排（如 GGGG），容易形成二级结构或滑移。
• 一对引物的 Tm 差控制在 5 °C 以内，否则退火温度对其中一条不合适。
• 自身互补与引物二聚体用引物二聚体检测单独查—— GC 与 Tm 都合格的引物照样可能高度自互补，这一页正文里就有这样的例子。