DNA 序列 GC 含量与 Tm 值在线计算
GC 含量决定双链的稳定性：G-C 之间三个氢键，A-T 只有两个，所以 GC 越高，解链温度越高。 引物设计一般把 GC% 控制在 40–60%。
Tm（解链温度）这里给两个经验公式，它们的适用长度不同，别用错：
- Wallace 规则，适用于 14 nt 以下的短寡核苷酸：
Tm = 2×(A+T) + 4×(G+C) - GC 经验公式，适用于约 14–50 nt：
Tm = 64.9 + 41×(G + C − 16.4) / N
需要说清楚的是：这两个都是经验估算，没有考虑盐浓度、引物浓度和最近邻热力学参数。 真要定 PCR 退火温度，请用厂商提供的最近邻（nearest-neighbor）算法，或直接做梯度 PCR。 本工具的定位是快速筛掉明显不合格的候选序列。
分子量按单链 DNA 计算（含 5’ 磷酸），公式为各碱基单核苷酸分子量之和减去 (n−1) 个水分子。
常见问题
两个 Tm 结果不一样，该信哪个？
看序列长度。14 nt 以下用 Wallace 规则，14–50 nt 用 GC 经验公式。两个都是估算，定退火温度请以最近邻算法或梯度 PCR 结果为准。
为什么我的引物 GC 含量合格却扩增不出来？
GC% 只是最粗的一层筛选。还要检查 3' 端是否形成发夹、引物二聚体、以及在模板上是否唯一。本工具不做这些检查。