z 堆栈层间距计算器（轴向分辨率与 Nyquist 采样）
拍 z 堆栈时，层间距（z-step）定错了，后果不是「图糊一点」， 而是三维重建的形状是错的：步长太大，一个球形的核在正交视图里会变成扁的； 步长太小，层数翻倍、光漂白翻倍，而信息一点没多。
决定步长的不是「我设 0.5 µm 一直这么用」，是轴向分辨率被几层采到。
两步
轴向分辨率 r_z = F × λ_em × n ÷ NA² F：宽场 2.0，共聚焦 1.4
层间距 Δz = r_z ÷ 2.3
n 是浸没介质的折射率（空气 1.00、水 1.33、甘油 1.47、硅油 1.405、油 1.515），
不是样品的。λ_em 用发射波长，不是激发波长。
注意 NA 出现在分母的平方上：NA 从 1.0 提到 1.4，轴向分辨率改善一倍， 而横向只改善 1.4 倍。轴向永远是三个方向里最差的那个， 油镜 NA1.4、发射 550 nm 下横向约 0.24 µm、轴向约 0.60 µm，差了两倍半。
为什么共聚焦是 1.4，宽场是 2.0
共聚焦的针孔挡掉了焦面外的光，轴向 PSF 因此被压短。 1.4 ÷ 2.0 = 0.70，也就是缩减 30%——这个数字和 Evident 用文字说的 「共聚焦的轴向 PSF 比宽场缩减约 30%」完全吻合，两个系数互为佐证。
需要留意的是这个 30% 比很多人以为的小。共聚焦真正的优势是去掉焦面外的杂散光 （对比度），不是把轴向分辨率提高几倍。
为什么除以 2.3，不是 2
经典 Nyquist 说采样间隔取最小可分辨距离的一半。那条结论的前提是结构 正好沿着采样网格方向排列；斜着的结构在对角方向上要求更密， 所以实践里用 2.3。本站的 microscope-pixel-size 横向用的是同一个 2.3。
可以验算
| 条件 | 轴向分辨率 | 层间距（÷2.3） |
|---|---|---|
| 共聚焦 λ550 NA1.4 油 n1.515 | 595.2 nm | 258.8 nm |
| 宽场 λ550 NA1.4 油 n1.515 | 850.3 nm | 369.7 nm |
| 共聚焦 λ520 NA1.0 水 n1.33 | 968.2 nm | 421.0 nm |
| 共聚焦 λ520 NA0.45 空气 n1.0 | 3.595 µm | 1.563 µm |
第一行就是文献里常说的「共聚焦最好约 0.2 µm 横向、0.6 µm 轴向」那组数 （PMC6961134），可以当作这个工具是否算对的判据。 第四行说明干镜做 z 堆栈的轴向分辨率只有微米量级—— 这种时候纠结几十纳米的步长没有意义。
适用边界
- 还有一条更严的判据，给反卷积用的。 Huygens/SVI 走的是 OTF 截止频率的 严格带限，宽场 Δz = λ ÷ (4n(1−cos α))、α = arcsin(NA/n)，共聚焦再加密一倍。 同样是油镜 NA1.4、λ550，它给 147 nm，本工具给 370 nm，差 2.5 倍。 两个都不是错的——一个量带宽，一个量半高宽。 要做反卷积就按带限那套走（层数会多一倍多），只做展示或测形态用本工具的即可。
- NA 不可能大于浸没介质的折射率，填反了工具会直接报错。 常见错误是选了「水」却填油镜的 NA 1.4。
- 公式是衍射极限下的理论值，是能达到的上限。实际还会被球差、折射率失配、 信噪比拉差，真实的轴向分辨率总是比算出来的更差，差多少取决于具体系统。
- 折射率失配会让 z 轴刻度本身不准：用油镜（n 1.515）拍水性样品（n ≈ 1.33）时， 载物台走 1 µm 对应样品里并不是 1 µm，深度越深偏差越大。这是形状失真的 另一个来源，和步长无关，换不出来——只能换匹配的物镜或做轴向校正。
- 不处理双光子、光片、超分辨。这几类的轴向行为由别的机制决定。
常见问题
层间距设成多少才算对？
按轴向分辨率除以 2.3。油镜 NA1.4、发射 550 nm、共聚焦，轴向分辨率约 0.60 µm，层间距约 259 nm——也就是常说的「0.25 µm 左右」。**不要固定用某一个数**：换成 NA 0.45 的干镜，同样的波长轴向分辨率是 3.6 µm，正确步长约 1.56 µm，再用 0.25 µm 的步长就是白拍 6 倍多的层数。
为什么共聚焦只比宽场好 30%？我以为共聚焦的层切能力强很多。
强的是**对比度**，不是分辨率。针孔挡掉焦面外的光，所以共聚焦的单层图看起来干净得多；但轴向 PSF 的半高宽只缩短到宽场的 0.70 倍（系数 1.4 对 2.0）。把「看起来层次分明」当成「轴向分辨率高几倍」是常见误解——真要提高轴向分辨率，得靠更大的 NA 或者换 4Pi / 光片 / 超分辨那类方法。
用激发波长还是发射波长？
荧光成像用**发射波长**，因为成像的是发出来的光。两者通常差几十纳米，对结果的影响是线性的：488 激发、520 发射，用 488 去算会把分辨率算好 6%，不致命但没必要。多通道一起拍时按**最长的发射波长**取步长，这样每个通道都够采。
反卷积软件要我设更小的步长，是它错了吗？
不是，它用的是另一套判据。Huygens/SVI 按 OTF 截止频率做严格带限，宽场 Δz = λ ÷ (4n(1−cos α))，共聚焦再加密一倍；同样油镜 NA1.4、λ550，它给 147 nm，本工具给 370 nm，差 2.5 倍。两者回答的不是同一个问题——一个量带宽，一个量 PSF 半高宽。**做反卷积就听反卷积软件的**，它需要把截止频率以内的信息全采到；只做展示或测形态，本工具的步长够用且省一半以上的光漂白。
算出来的分辨率和我实际量到的对不上。
正常，理论值是衍射极限下的上限，实测只会更差。常见原因：球差（盖玻片厚度不对、浸油型号不对）、折射率失配、信噪比不足（弱信号下 PSF 的尾部测不出来）、物镜实际 NA 达不到标称值。另外**折射率失配还会让 z 轴刻度本身不准**：油镜拍水性样品时，载物台走 1 µm 在样品里并不是 1 µm，深度越深偏得越多，这会直接让重建出来的形状变形。
横向的采样该怎么定？
那是另一个问题，看相机像元尺寸和放大倍率，本站有专门的工具：[显微镜像素尺寸与 Nyquist 采样](../microscope-pixel-size/)。两边用的是同一个 2.3 采样系数，可以放心一起用。